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目的ESAT-6蛋白是结核分枝杆菌的毒力因子,为了用酵母双杂交方法筛选易感家畜动物细胞中与该蛋白分子相互作用的分子,本实验构建了ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体。方法根据结核分枝杆菌H37Rv的ESAT-6基因序列（登录号:38490389）设计一对引物,P1:5’-GAATTCATGACAGAGCAGCAGTGGA-3’,P2:5’-GTCGACCTATGCGAACATCCCAGTG-3’下划线部分为限制性酶切位点EcoR I和SalI。以80℃作用30min热灭活结核分枝杆菌H37Rv菌悬液为模板,应用PCR技术（20μL PCR反应的体系中加入:10×反应缓冲液（含15mmol/L MgCl2）2μL,dNTP（各2.5 mmol/L）0.8μL,P1（25μmol/L）0.25μL,P2（25μmol/L）0.25μL,模板0.5μL,Taq酶0.75U,补水至20μL;PCR反应条件:94℃4min;94℃1min,52℃40S,72℃1min,30个循环;最后72℃延伸7min）特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因,将其克隆入pGM-T载体中,该质粒经PCR方法和限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切方法鉴定分析后,进行DNA测序鉴定。将序列正确的ESAT-6基因片段亚克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,用PCR和限制性酶切进行鉴定,构建了诱饵质粒pGBKT7-ESAT-6。用PEG/LiAc法（在每个1.5mL离心管中,加入诱饵载体pGBKT7-ESAT-6质粒0.1μg,再加入5μL鲑鱼精担体DNA（Herring Tests carrier DNA）及50μL酵母感受态细胞,轻轻混匀后,再加0.5mL PEG/LiAc溶液振荡混匀后,在30℃下振荡培养30min后,在管中加入20μL DMSO,混匀,于42℃水浴15min,冰浴1～2min,再于室温离心（12000r/min）15s,弃上清,用1mL YPD Plus液体培养基重悬酵母细胞,将转化的酵母细胞于30℃下振荡培90min,离心（3000 r/min）5min,弃上清,用0.9%（W/V）的NaCl溶液重悬酵母细胞,将酵母细胞悬液涂于SD/-Trp固体培养基上,30℃培养3d,可见白色克隆出现。转化时以pGBKT7-Lam和pGBKT7为对照质粒。）将其转入酵母AH109b中,经表型筛选（挑取直径大于2mm的克隆,混悬于200μL的0.9%（W/V）NaCl溶液中,再将此悬液分别涂于SD/-Leu和SD/-His固体培养基上,30℃培养观察4～5d。）检测其自激活作用。结果载有pGBKT7-ESAT-6质粒的酵母感受态细胞涂在SD/-Trp固体培养基上,培养3d,长出白色克隆。将此克隆接种于SD/-Leu固体培养基和SD/-His固体培养基上,培养3d,均无菌落生长（图8-2）。结论:本实验构建的pGBKT7-ESAT-6质粒无自激活作用,可用于酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子。