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研究目的:建立离体胰岛素抵抗模型既有利于在细胞和分子水平深入探讨胰岛素抵抗的发生发展机制,又有利于在体外进行胰岛素抵抗防治药物的研发和筛选,骨骼肌是胰岛素抵抗发生的主要部位,因此建立稳定可重复的骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型至关重要。鉴于目前关于建立骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的研究报道实验条件不一,方法各异,且胰岛素抵抗效果不稳定,本课题组在离体胰岛素抵抗模型建立中进行了较长期的研究。长期高糖是导致胰岛素抵抗和2型糖尿病的直接原因,也是体内胰岛素抵抗和2型糖尿病的主要特征,以高糖干预建立胰岛素抵抗离体模型对于胰岛素抵抗的在体研究具有更好的参考意义,本研究通过采用不同浓度葡萄糖干预C2C12不同时长,实时收集细胞检测其基础和胰岛素刺激下的荧光标记葡萄糖2-NBDG摄取水平和胰岛素信号通路相关蛋白的表达水平,探索高糖刺激与C2C12胰岛素抵抗之间的量效关系,期望构建稳定可重复的骨骼肌细胞离体胰岛素抵抗模型,促进胰岛素抵抗和相关疾病的病理机制探索及相关药物研发与筛选,进而推进胰岛素抵抗等慢性疾病的防治研究。研究方法:采用小鼠成肌细胞C2C12为研究对象,分别以正常分化液和含40、60mmol/L葡萄糖的分化液诱导分化,1)每天应用相差显微镜观察不同浓度葡萄糖处理对细胞汇聚、融合和形成多核肌管的影响;2)分化1、3、5、7天后应用2-NBDG法检测不同处理对细胞基础糖摄取和胰岛素刺激糖摄取的影响;3)分化5天和7天后应用Western blot方法检测不同干预对葡萄糖转运子4(glucose transporter 4,GLUT4)蛋白表达的影响;4)分化5天后应用免疫荧光组化方法检测不同干预对GLUT4蛋白分布的影响。研究结果:60mmol/L葡萄糖处理:1)相差显微镜观察结果从形态学上显示高糖处理C2C12细胞3天后明显抑制细胞增殖分化,且存在时间依赖性,随着干预时间延长,对成肌细胞增殖分化的抑制更加明显,这将导致细胞葡萄糖摄取能力减弱,加快胰岛素抵抗和糖尿病的发展进程。2)葡萄糖摄取结果表明高糖处理5和7天后均明显抑制C2C12的基础糖摄取和胰岛素刺激的糖摄取(P<0.01),且处理5天后胰岛素刺激的糖摄取与基础糖摄取无差异(P>0.05),提示高糖干预明显降低C2C12基础和胰岛素刺激的糖摄取能力,且存在时间依赖性,以60mmol/L葡萄糖干预5天出现明显抑制,干预7天抑制效果进一步加强,说明60mmol/L葡萄糖干预5天后导致细胞葡萄糖摄取能力和胰岛素敏感性显著下降,产生胰岛素抵抗。3)Westernblot检测结果表明高糖处理5和7天后,胰岛素刺激的GLUT4表达与基础GLUT4表达无差异(P>0.05),而对照组差异显著(P<0.05),提示高糖干预明显降低C2C12基础和胰岛素刺激的GLUT4蛋白表达,且存在时间依赖性,60mmol/L葡萄糖干预5天明显抑制,干预7天抑制效果进一步加强,说明60mmol/L葡萄糖干预成肌细胞5天后导致胰岛素信号转导通路受损,到第7天后,受损程度进一步加深。4)免疫荧光组化检测结果表明高糖处理5天后明显减少C2C12细胞胞膜上GLUT4蛋白分布水平(P<0.01),提示高糖干预5天明显降低C2C12细胞膜GLUT4表达量,说明60mmol/L葡萄糖干预不仅导致细胞中GLUT4蛋白表达降低,同时抑制葡萄糖刺激的GLUT4蛋白向细胞膜的转运,进而抑制C2C12细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取,导致胰岛素敏感性降低。40mmol/L葡萄糖也一定程度抑制成肌细胞增殖分化,导致成肌细胞葡萄糖摄取能力和GLUT4激活水平下降,但效果不如60mmol/L葡萄糖明显和稳定。研究结论:本研究通过高糖刺激成功构建较为稳定的小鼠骨骼肌细胞离体胰岛素抵抗模型,以60mmol/L葡萄糖刺激5天效果最好,通过形态学观察并检测基础和胰岛素刺激的葡萄糖摄取能力和GLUT4蛋白表达与分布能较好评价骨骼肌细胞离体胰岛素抵抗水平。