研究背景:恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病。嵌合抗原受体(CAR)T细胞是一种基因工程T细胞,能够特异性的识别肿瘤抗原,杀伤肿瘤细胞,从而治疗肿瘤。NKG2D是调节细胞毒性细胞的主要调节因子,可识别肿瘤细胞或病毒感染细胞表面表达的八种不同配体,发挥细胞毒作用,执行机体免疫监视的功能。以NKG2D的胞外区作为CAR的识别功能区,具有识别多种不同肿瘤细胞的能力,有较大的潜在抗肿瘤谱。研究目的 :构建具有NKG2D胞外功能区的广谱识别肿瘤细胞的新型CART细胞,并通过体内外实验研究,验证其抗肿瘤的作用。研究方法 :本研究利用基因合成,酶切和PCR构建等技术,设计并合成了NKG2D胞外功能区序列,构建了NKG2DScfv-CD28-CD137-CD3ζ/CAR的基因片段,并以pHAGE-CMV-hIL7-IRES-ZsGreen-W为载体,成功制备了包含有NKG2D/CAR的慢病毒载体。采集分离健康人外周血中的PBMC,在体外采用抗CD3、抗CD28抗体标记的磁珠及IL-2,制备表达NKG2DScfv-CD28-CD137-CD3ζ的CART细胞。将所获得的CART细胞分别与SMMC7721细胞系、A549细胞系体外同培养,采用ELISA法检测上清中细胞因子的浓度。同时,在免疫缺陷小鼠(NPG)体内,通过局部注射SMMC7721细胞系与A549细胞系,分别制备获得荷瘤肝癌及肺癌的动物模型。在此基础上,对荷瘤小鼠分别输注胞外段表达NKG2D的CAR T细胞,观察荷瘤动物的生存时间、肿瘤体积和转移情况等指标。研究结果 :结果表明,NKG2D-CAR T细胞与肿瘤细胞共培养时可释放G-CSF、IFN-γ和TNF-α等细胞因子,使细胞培养上清中的这些细胞因子浓度升高。在对荷瘤动物的治疗实验中,未经CART细胞输注的对照组的肺癌和荷瘤小鼠,生存状态差,出现束毛和腹腔严重腹水等表现,并最终死亡。病理解剖可见肿瘤细胞在小鼠体内呈播散性生长,肿瘤中心组织可见缺血坏死病灶。NKG2D-CAR T细胞治疗组的动物,生存期显著延长,体内肿瘤生长局限,体积明显小于对照组,肿瘤组织中可见浸润的T细胞。结论 :本研究构建和制备成功了具有NKG2D胞外功能区的CAR T细胞,并在体外和人肺癌及肝癌移植的动物模型体内,证实其具有杀伤多种肿瘤细胞的能力,为验证NKG2D-CAR T细胞的广谱抗肿瘤效应,提供了初步的研究证据。