4个小麦叶锈菌效应蛋白的功能分析

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小麦叶锈病是由小麦叶锈菌侵染的一种气传性真菌病害,在全世界范围均有发生,造成小麦严重的产量损失。防治该病害最为安全、经济、有效的方法是抗病品种的利用,但由于小麦叶锈菌致病性多样化及毒性的频繁发生变异,导致小麦抗叶锈性不断丧失,因此,探讨小麦叶锈菌致病的分子机制对于有效控制小麦叶锈病尤为重要。前期在三个小麦叶锈菌单胞菌系08-5-9-2 (KHTT)、13-5-28-1 (JHKT)和13-5-72-1 (THSN)休眠孢子、萌发夏孢子和侵染6 d时期的小麦叶锈菌转录组文库中筛选到20个与Lr20候选无毒基因具有同源性的基因候选效应因子。通过对筛选到的20个候选效应因子利用全套的近等基因系进行检测,结果发现基因Pt13024在近等基因系TcLr30、TcLr42、TcLrB、TcLr38、TcLr19和TcLr11上出现了坏死反应。其中,基因P18906在近等基因系TcLr10+27+31和TcLr42上出现了坏死反应,基因Pt20911在近等基因系TcLr25和TcLr38,Pt3863在近等基因系TcLr18、TcLr1、TcLr10和TcLr2a上出现了坏死反应。研究表明这4个效应因子触发了寄主相应的防御反应,小麦中存在与效应蛋白互作的分子靶标。之后我们利用qRT-PCR检测效应蛋白基因在小麦叶锈菌生理小种13-5-28-1和13-5-72-1侵染Thatcher叶片0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、6 d、9 d和12 d后的表达量,发现4个基因均在24h表达量达到了最高峰,而接种后24小时是小麦叶锈菌产生吸器母细胞和形成吸器的阶段,也是病原与寄主作用激烈的阶段,因此猜测这4个基因可能与叶锈菌吸器的形成有关。为了知道基因抑制坏死以及在寄主上产生坏死的作用部位,我们利用烟草进行亚细胞定位试验得知4个基因定位在细胞核以及细胞质,效应蛋白在细胞内起作用。之后为了明确效应蛋白的真正作用位点,我们对4个效应蛋白进行了缺失突变,发现功能区域在去掉信号肽后N末端的前20个氨基酸。然后我们进行了信号肽分泌功能的验证,发现基因Pt13024、Pt20911和Pt3863的信号肽是有分泌功能的,基因Pt18906的信号肽没有分泌功能。最后我们对4个基因进行了原核表达载体的构建,发现4个基因都能够表达成蛋白。后续我们将利用HIGS沉默技术验证效应蛋白在寄主与病原菌互作中的作用,利用酵母双杂技术筛选效应蛋白的互作靶标,这对我们揭示病菌的致病机理具有重要意义。
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