甜菜夜蛾SeGrx1基因的克隆原核表达纯化及酶动力学研究

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克隆甜菜夜蛾(Spodoptera exigua,H(u|¨)bner)的谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx)基因,构建甜菜夜蛾的谷氧还蛋白原核蛋白表达系统,最终得到高纯度的谷氧还蛋白,并测定SeGrx1的酶动力学参数。RACE技术克隆甜菜夜蛾SeGrx1基因全长,构建pET16b-SeGrx1原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍柱初步纯化裂解菌液上清可溶性蛋白,Tev酶切除融合蛋白的6x His标签,再用Superdex75/200分子筛进一步纯化,目的蛋白的Western-bloting (WB)验证,酶动力学参数测定。SeGrx1基因的GeneBank的注册号MK318813,构建了表达效率很高的pET16b-SeGrx1重组质粒,最佳诱导方式:在细菌生长至OD600=0.6时加入终浓度0.5mM的IPTG,30℃诱导4h;最佳纯化方式为:先用镍柱纯化菌液上清中可溶性蛋白,20mM,50mM咪唑梯度洗脱杂蛋白,300mM咪唑洗脱融合蛋白;最佳酶切融合蛋白的条件为:在含有0.5mM EDTA和1mM DTT的酶切缓冲液中,去除融合蛋白中的高浓度盐和咪唑,在pro:tev=2:5时(质量比)可以得好的酶切效果;再用Superdex 75/200分子筛进一步纯化,可获得纯度在95%以上目的蛋白。WB验证我们所表达的蛋白就是SeGrx1,以谷胱甘肽还原酶作为反应底物测定酶的活性为3.1倍hGrx1活性,酶学动力学参数Vmax=13.87 (±0.083),Km=6.5 (±0.17)×10~(-3)。成功在体外大量表达高纯度高活性的甜菜夜蛾谷氧还蛋白Grx1,并且获得了它的酶学动力学参数,将为进一步挖掘谷氧还蛋白的生物学功能,为探索以谷氧还蛋白作为特异性杀虫剂靶标打下了基础。
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