近年来,非生物胁迫特别上低温、干旱和盐害对农作物产量的影响日益严重,如何提高农作物抵抗不良外界环境的能力在农业生产上具有重要意义。随着生物技术的发展,转基因技术已经成为培育植物新品种的重要手段,许多重要性状已经通过此方法得到改良,而抗旱、耐盐和抗寒等抗逆能力的提高划成为近几年研究的热点。与此同时,公众对标记基因及其产物安全性的质疑也成为植物转基因面临的一个重要问题.所以,构建环境友好型的安全转化载体,对转基因植物今后的产业化具有重要意义。木糖异构酶(xylose isomerase,Ⅺ) 又称葡萄糖异构酶,该酶广泛分布于动物和部分植物体内,并且广泛应用于食品工业中,对人畜和环境均不会造成危害。大多数植物不能利用木糖为碳源,但是能够利用木酮糖,所以该基因可以作为筛选标记应用于植物转基因研究中。我们从 E.coli 基因组中克隆了木糖异构酶基因 XylA,其产物木糖异构酶能将 D-木糖转化为木酮糖。利用 XylA 为筛选标记,以 D-木糖为筛选剂,建立了一套安全的百脉根转基因技术体系,该体系的转化效率为45.5%,与除草剂筛选转化体系的效率(46.7%)相当,且转化周期比后者缩短10d 以上。利用该转化体系, 已相继把 HAL1、DREB2A 等基因转入百脉根,获得了抗逆性的转基因植株:将来源于酵母的耐盐基因 HAL1导入百脉根,经耐盐性鉴定其 NaCl 抗性为1.0%,比野生型(0.8%)抗性提高25%。在1.3%NaCl 条件下,转基因植株仍能生根;将来源于拟南芥的 DREB2A 转基因植株在缺水27d 的条件下,仍还存活,而对照植株在处理18d 后就已死亡。此外,我们还建立了脱氧葡萄糖筛选转化体系。2-脱氧葡萄糖是葡萄糖的类似物,它进入植物细胞质后,在磷酸激酶的作用下被磷酸化为2-脱氧葡萄糖-6-磷酸。2-脱氧葡萄糖-6-磷酸可以阻碍细胞呼吸、损害蛋白质的糖基化并能破坏细胞壁的形成,此外还阻碍糖酵解的进行和蛋白质的合成,这些作用最终导致细胞的死亡。2-脱氧葡萄糖磷酸酯酶可以水解2-脱氧葡萄糖-6-磷酸,为细胞解毒。在该体系中,选择基因为来源于酵母的2-脱氧葡萄糖磷酸酯酶基因 DOGR1,筛选剂为2-脱氧葡萄糖。由于选择基因的产物(2-脱氧葡萄糖磷酸酯酶)对人和动物没有毒性,而且2-脱氧葡萄糖作为一种临床药物对人畜也是安全的,所以该转化体系所获得的转基因植物是安全的。该系统的转化效率为35.6%,转化周期仅为100d。利用该转化体系已成功将 CBF1基因导入百脉根,试验表明,转基因植株的耐寒性得到显著提高,在受冷胁迫(4℃)处理后转基因植株的脯氨酸含量明显比对照植株的高,并在12h 时达到最高。这两套安全选择标记的一个共同点就是转化周期短,可以快速、高效地检测基因功能。