柑橘3种病原多重RT-PCR检测体系建立及其在重庆柑橘产区的应用

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柑橘是世界主要水果之一,总产量约占整个水果产量的1/4,我国柑橘产量居世界前列,重庆是农业部规划的优势柑橘产区之一,柑橘产业已成为重庆经济林果中重要的支柱产业。目前影响重庆柑橘生产的重要病毒病与类病毒病有柑橘衰退病、柑橘碎叶病和柑橘裂皮病,分别由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter-leaf virus,CTLV)及柑橘裂皮病类病毒(Citrus exoeortis viroid,CEVd)引起,这3种病原均可通过嫁接传播,CTV也可经蚜虫传播,在果园中经常以两种或两种以上病原混合侵染为害,对柑橘高产优质生产构成严重。常规PCR技术一次只能检测一种病原物,而多重PCR(Multiplex PCR)技术在同一反应管内同时加入多对引物,扩增完成后可同时检测出多种目的核酸片段,具有高效快捷和加速实验进程等优点。为了摸清重庆柑橘产区CTV、CEVd和CTLV 3种病发生状况,本文应用微量快速抽提法提取总核酸,选用病原特异引物,通过优化通过对影响PCR扩增效率和特异性的因素,同时设置了内参基因,建立了同时检测CTV、CEVd和CTLV 3种柑橘病原的一步法、双温多重PCR检测技术体系,分别扩增出511 bp、371 bp和309 bp的相应特征片段,应用该体系快速评价了3种嫁接传播病原在田间侵染情况,结果表明,CTV是重庆地区的主导病毒,而CTLV和CEVd零星分布。该多重RT-PCR体系也可用于快速评价茎尖嫁接苗的病毒病脱除情况。
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