海南亚龙湾红树林放线菌的分离及抗阴性革兰氏菌活性物质的研究

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近十年来,革兰氏阴性(G-)菌耐药状况日益严重,尤以耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(肺炎克雷伯、大肠埃希菌杆菌等)和非发酵细菌(鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等)耐药问题最为突出[1,2]。然而,随着细菌耐药日益严重,具有全新结构骨架和作用机制的新型抗菌药物研发严重匮乏[3,4]。放线菌是抗生素的最重要的生物来源。现今发现的2万多种微生物来源的天然抗生素化合物,约40%是由放线菌产生[5]。因此,研发新型有效的抗阴性菌药物成为刻不容缓的全球性课题。红树林分布于热带和亚热带海陆潮间带,拥有独特而高生产力的湿地生态系统,作为一种从陆地向海洋过度的森林生态系统蕴藏着巨大的生物多样性[6]。从红树林放线菌分离的化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性[7]。因此,红树林是筛选和发现放线菌新物种和生物活性次级代谢产物的宝贵资源。本文旨在勘探海南红树林地区的沉积物中放线菌多样性,为发现放线菌新物种和新抗生素奠定基础,并对具有抗阴性革兰氏菌的放线菌进行筛选。本研究选取3份来自红树林海岸沉积物的样品采用3种预处理方法,11种分离培养基进行分离;通过PCR扩增,并比对16S rRNA基因序列及抗菌活性测定进行初步鉴别;经液体发酵,发酵产物离心后,上清经XAD7HP大孔树脂色谱手段获得提取物,通过琼脂纸片扩散法对样品进行抗菌活性筛选,并运用HPLC、LC-MS等方法对其代谢产物进行分析。经表观形态特征排重,从3份海洋沉积物种共分离菌株103株(包括35株细菌,68株放线菌),分布于15科19属,其中链霉菌属为优势菌属,菌株IMB16-140的16S rRNA基因序列与最近有效菌株Saccharopolyspora gloriosae(EU005371)的相似率为97.74%。发酵103株菌,发酵提取物活性结果表明,对至少一种检定菌显示活性的共68株,总阳性率为66%;对至少一种革兰氏阴性检定菌有活性的有37株,包括5株对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC700603有活性,10株对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 27853有活性,16株对"超级耐药菌"摩氏摩根抗性菌(Morganella morganii)KL-225有活性;对至少一种阳性菌有活性的共有31株,包括15株对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)R6101有活性。利用PCR扩增对18株菌株进行FADH2依赖型卤化酶、dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶(dTGD)、L-色氨酸聚合酶(StaD)等生物合成基因进行筛选,获得含FADH2依赖型卤化酶、dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶(dTGD)、L-色氨酸聚合酶(StaD)等生物合成基因的潜在菌株分别6、9、1株。对菌株IMB16-191进行基因组测序,通过antiSMASH 4.0对次级代谢生物基因进行分析,提示这些菌株产生的次级代谢产物结构类型可能有萜烯、Ⅰ型聚酮合酶(T1pks)、Ⅱ型聚酮合酶(T2pks)、非核糖体肽(NRPS)、羊毛硫肽类(Lantipeptide)等。从中可以看出红树林沉积物中存在较为丰富的放线菌资源,且有从中发现放线菌新物种及新抗生素的潜力。
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