目的铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化诱导的非凋亡性调节性细胞死亡（RCD）,可参与肿瘤细胞杀伤作用。研究报道半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡依赖于线粒体,铁死亡的核心调节因子谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的N端具有线粒体定位序列,且富马酸盐共价修饰GPX4Cys93可抑制其活性促进铁死亡,提示GPX4功能存在翻译后修饰调控。课题组前期预测和筛查了GPX4存在多个潜在（去）磷酸化位点,但其特定位点磷酸化/去磷酸化修饰的功能尚待研究。本研究拟探讨GPX4中N端丝氨酸2位点（GPX4Ser2）磷酸化状态介导线粒体p53质核分布调节及其在诱导肝癌细胞铁死亡中的作用。方法:利用GEO数据库筛选HCC病例进行肝组织中相关基因表达关联性分析;构建GPX4稳定高表达及GPX4的Ser2、Ser112定点突变模拟高磷酸化（S>D）和去磷酸化（S>A）的人肝癌HepG2和Huh-7细胞定点突变细胞株,给予索拉非尼(Sora,10μmol·L-1,24 h)处理建立诱导性肝癌细胞铁死亡模型,Ferrostatin-1(Fer-1,1μmol·L-1,24 h)干预建立铁死亡抑制模型进行体外试验;免疫印迹实验（WB）检测GPX4蛋白水平;流式细胞术（FCM）检测C11-BODIPY探针标记的脂质过氧化状态;MTS法检测细胞活力;分离胞浆、线粒体组分,采用线粒体免疫共沉淀法（Mito-IP）检测GPX4与p53相互作用;免疫荧光（IF）激光共聚焦显微镜观察p53在线粒体（Mitotracker）和细胞核（DAPI）的定位分布变化。结果①HCC病例数据库中（GSE76427）,与癌旁组织（n=52）相比,肝癌组织（n=115）中铁死亡敏感性负调控因子及肿瘤增殖相关的ECAD基因相对表达水平下调、铁死亡相关的GPX4基因相对表达水平上调,且二者呈负相关（P<0.05）;②与对照组相比,Sora处理组诱导性铁死亡HepG2与MHCC97H细胞中GPX4水平及细胞活力均下降（P<0.05）、且Fer-1干预组细胞中GPX4水平及细胞活力均升高（P<0.05）,但各组Huh-7细胞中未见差异;③与对照细胞相比,GPX4稳定高表达的HepG2-GPX4细胞在Sora处理组未见脂质过氧化指标的明显改变;④与HepG2-GPX4对照细胞相比,模拟GPX4去磷酸化的HepG2-GPX4-S2A细胞中脂质过氧化水平增加（P<0.05）,提示GPX4Ser2去磷酸化参与铁死亡的诱导发生;与模拟GPX4高磷酸化的HepG2-GPX4-S2D细胞相比,Sora处理组HepG2-GPX4-S2A细胞中Mito-IP可见GPX4与p53在线粒体上互作减少,IF实验可见p53（绿色）和细胞核（蓝色）的共定位（青色荧光点）增加、p53（绿色）和线粒体（红色）共定位（黄色荧光点）减少,细胞活力下降（P<0.05）、且Fer-1干预组细胞活力升高（P<0.05）,提示p53由线粒体逆行转位至细胞核与诱导性铁死亡有关。⑤与Huh-7-GPX4-S2D细胞相比,Sora处理组Huh-7-GPX4-S2A细胞中脂质过氧化水平增加、细胞活力下降（P<0.05）。结论 GPX4Ser2去磷酸化可经由其线粒体分布调控线粒体p53逆行入核信号参与诱导性铁死亡的调节;结果为筛查GPX4功能性（去）磷酸化修饰位点及阐明其蛋白磷酸酶（如PP2A）调控在肝致癌作用中的分子机制和靶向干预介导肝癌细胞铁死亡依赖性肿瘤化学预防提供实验依据。