论文部分内容阅读
背景:川崎病(Kawasaki disease,KD)又称小儿皮肤黏膜淋巴结综合征,是一种好发于婴幼儿的免疫介导系统性血管炎。其发病机理尚不清楚,多数学者认为川崎病与遗传,基因易感性及外界感染相关。有研究报道在川崎患者血清中能检测到部分IgG抗体及功能蛋白的高表达,但仍然缺乏特异性的生物标志物作为诊断靶标,目前川崎病的诊断常依据临床症状,约有15-25%患儿未能得到及时诊断治疗的患者会出现不同程度的冠状动脉损害。目的:利用蛋白质组学和分子生物学方法,筛选川崎病自身免疫靶点,并检测其在川崎病临床诊断中的价值。方法:首先利用细胞间接免疫荧光技术,筛选出川崎病免疫靶点细胞。提取细胞全蛋白进行Western Blotting(WB)分析,利用川崎病人血清作为抗体识别细胞全蛋白中的抗原。对识别出的未知抗原进行LCMALDI-TOF/TOF质谱分析鉴定,利用基因工程技术克隆表达筛选出的候选抗原。利用ELISA技术检测川崎病人外周血中该抗原对应抗体滴度,同时对比发热非川崎对照(febrile non-KD,FC)和健康对照(age-matched healthy donors,HC),对其在川崎病诊断中的潜在价值进行统计分析。结果:根据Image J软件对细胞荧光强度的统计分析,HeLa细胞间接免疫荧光结果中,KD组荧光强度明显高于FC及HC,P值均小于0.05,具有统计学意义。细胞全蛋白WB实验中,53 kDa处蛋白被成功识别,12个KD血清样本中出现了4个阳性条带,质谱鉴定为USTB-58蛋白,通过基因工程技术在大肠杆菌表达系统中发酵表达,利用Ni-NTA亲和纯化得到重组人源USTB-58纯蛋白。对获得的USTB-58蛋白进行ELISA分析,当Cut-off值取0.282(健康对照组OD均值+2SD)时,KD血清阳性率为32%(16/50),而相应的FC和HC阳性率分别为21%(8/38),2.6%(1/38)。SPSS软件对ELISA结果的统计分析显示,KD组与FC,HC均存在显著性差异。结论:本研究提供了USTB-58蛋白作为KD自体免疫靶点的证据,其对川崎病的检出率为32%。然而,USTB-58作为川崎免疫靶点在发病机制中的作用有待进一步的研究。