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【目的】乳品中富含蛋白质、氨基酸、矿物质等多种营养成分,口感佳、易消化,深受消费者青睐。但是乳品的质量与安全严重制约了我国乳品行业的发展。如何保障乳品的质量与安全成为生产企业与消费者共同瞩目的焦点。微生物污染是威胁乳品安全的主要因素之一,受到微生物污染的乳品会变质、腐败、胀袋。致病微生物污染还可能会引发食物中毒,威胁消费者的健康。国标常规检测方法耗时长(24h以上),不适用于乳品加工企业现代化生产模式,因此,乳品中微生物快速检测技术的研发备受乳品企业关注。本实验拟采用叠氮溴化丙锭(PMA)结合qPCR对乳制品样品中活菌DNA进行定量,分别建立一种快速检测巴氏杀菌乳中细菌与发酵乳中酵母菌活菌总数的检测方法。【方法】首先采集广泽乳业生产的巴氏杀菌乳及发酵乳样品约600份,分离巴氏杀菌乳中污染的细菌与发酵乳中污染的酵母菌,通过形态学观察、分子生物学与生化实验对分离得到的微生物进行鉴定。然后分别优化不同菌种的PMA处理条件。通过qPCR定量分析,分别建立细菌及酵母菌的菌浓度对数与相应Ct值的标准曲线。参照国标GB19645-2010与GB19302-2010,分别确定巴氏杀菌乳中细菌总数与发酵乳中酵母菌总数超标的参考Ct值范围。分别对巴氏杀菌乳与发酵乳实际样品进行PMA-qPCR法、qPCR法及国标法检测,验证PMA-qPCR检测方法的准确性。【结果】巴氏杀菌乳中污染的细菌包括:阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、蜂房哈夫尼亚菌、阪崎肠杆菌、溶血链球菌、格式乳球菌、中间葡萄球菌、绿浅气球菌、溶血性葡萄球菌、克氏库克菌。发酵乳中酵母菌包括:马克斯克鲁维酵母菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母菌、热带假丝酵母菌。确定巴氏杀菌乳中细菌最佳PMA工作浓度为15μg/mL,暗孵育时间10 min,曝光时间15 min。发酵乳中酵母菌最佳PMA工作浓度为15μg/mL,暗孵育时间与曝光时间均为10 min。qPCR定量分析结果显示:巴氏乳奶样品中细菌浓度为10~5CFU/mL的Ct范围为27.24~30.85;发酵乳样品中酵母菌浓度为10~2CFU/mL的Ct范围为34.81~34.98。该方法的检测周期为4 h,准确率高于90%。