PCR-DGGE手段鉴定伪无菌小鼠定植大熊猫肠道菌群的效果研究

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大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)作为一种被高度重视的保护动物,完善对其肠道菌群的研究手段对于大熊猫生理机能、病理分析及药物研发等领域均具有极为重要的作用。然而近年来尽管对大熊猫的肠道菌群研究日益深入,由于其自身的稀有及政策的限制,绝大部分研究依旧集中于对大熊猫所排泄出的粪便,并以此推测动物机体内部的情况,这一限制直接导致研究的严谨性受损,并彻底限制了对其菌群结构进行人为调控研究的可能性。近年来,通过转移某种动物的肠道菌群至另外一类更易操作的动物体内,形成诸如肠道菌群人源化小鼠等技术开始逐渐成熟,并提供合理的参考。在珍稀动物领域,该方法为大熊猫等保护动物进行在体实验提供了一种新的方式和可能。本实验使用抗生素处理小鼠的肠道来得到伪无菌小鼠,并接种定植大熊猫的肠道菌群,结合PCR-DGGE(polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis)技术,旨在得到更符合大熊猫肠道菌群特征的小鼠模型,为开展研究研究大熊猫的体内机制探寻动物模型并提供理论依据。本试验选择了10只成年健康大熊猫的粪便样本(来自成都大熊猫繁育研究基地),提取各自的粪便菌群DNA以及混合样本后的粪便菌群DNA,利用PCR-DGGE技术,得到条带后进行聚类分析,分别分析其菌群结构的相似性和多样性之间的差别;选择20只四周龄左右雌性昆明小鼠,饲喂一周缓冲后,连续灌喂五天链霉素,一日两次,随后分为两组(单次组及多次组),分别接种一次及三次(每日一次)混合的大熊猫粪便细菌悬液,选取造模后第三天的粪便,进行PCR-DGGE分析,比对两试验组以及大熊猫粪便菌群的菌群结构相似性及多样性差异。试验结果如下:1.混合后的熊猫粪便菌群均一性高,且相似度(>95%)远高于单只熊猫的平均相似度(74%),更加符合造模的条件,因此在后续实验中选择使用混合的大熊猫粪便样品进行菌群移植;2.造模后小鼠粪便菌群与熊猫粪便菌群的平均相似度显著提高,达到36%以上,显著高于普通小鼠与大熊猫粪便的菌群相似度对比值;3.通过组间比较,多次灌喂的小鼠粪便菌群的组间相似性(70%)显著高于单次灌喂组(低于50%),组间更加稳定;多次灌喂的结果,条带数间的差异显著低于单次灌喂(P<0.05),稳定性明显提升。结论:利用抗生素处理得到的伪无菌小鼠,可以用于建造大熊猫源化的小鼠肠道模型,并且多次灌喂可以使得模型更加稳定。该实验结果将为后续开展更为严谨和深入的大熊猫源化小鼠模型建造提供重要的理论依据。
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