二硫键是一种重要的蛋白质翻译后修饰,对于蛋白结构和功能具有重要影响。目前解析二硫键连接位置的方法主要包括自下而上(bottom-up)和自上而下(top-down)两种。相比于bottom-up而言,top-down方法可有效避免二硫键位置信息的丢失,越来越多地被应用于二硫键的研究中1,2。在本研究中,我们采用MALDI-TOF/TOF对乳球蛋白中的二硫键重构现象进行了研究。为了实现乳球蛋白母离子的有效碎裂,我们以2-NPG为基质3,使乳球蛋白在MALDI过程中产生多电荷离子(图1b)。随后我们选择其两电荷离子进行TOF/TOF分析,得到了二硫键断裂的特征性三重碎裂峰,分别对应y,y-S,y+S离子(图1c)。随后,我们将乳球蛋白在不同温度下加热,观察其二硫键的重排过程。发现当温度到达75oC,二硫键的特征碎片(y-S和y+S)有个陡降(图1d)。这些二硫键断裂的峰都在C121及C160之间(y25,y32,y33),因而推断连接C160的二硫键减少了,亦即发生了二硫键的重排4。通过天然质谱(native MS)分析加热前后的乳球蛋白发现,电荷分布没有明显变化,说明二硫键的重构未明显影响该蛋白的高级结构。文中所述的方法还可用于其他较大蛋白质的top-down分析,某些含二硫键的蛋白也可以得到较好的解析。