论文部分内容阅读
目的:研究TopBP1与Claspin如何协同作用于 ATR-Chk1信号传导通路。方法:建立了分别针对TopBP1 与Claspin的诱导下调型的细胞系,免疫印迹法检测ATR下游底物总蛋白及磷酸化蛋白的表达,免疫荧光法检测TopBP1 与Claspin在DNA损伤后细胞内的分布。免疫沉淀法检测 Claspin与Chkl的结合。结果:1．建立了分别诱导下调 TopBP1与Claspin的细胞系,在给予Doxycyclin诱导后在 72小时与24小时这两种蛋白的表达达到最低点。在这两个时间点上,两种蛋白的下调并不干扰细胞周期的变化。2． TopBP1或Claspin的下调使DNA损伤导致的Chk1激酶的磷酸化显著受阻。3．在紫外线或羟基脲导致的DNA损伤中, 在TopBP1下调的细胞,所有的ATR底物磷酸化均受阻,而在Claspin下调的细胞,仅Chk1磷酸化受阻。给予这两种细胞系以2Gy的照射,在这两种细胞系中我们观察到Nbs1与 Smc1的磷酸化未受影响,然而,Chk1的磷酸化(s317与s345) 明显地依赖于TopBP1与Claspin。另外,用siRNA单独地或合并起来下调这两种蛋白,然后检查给予UV损伤后的Chk1 磷酸化,同样地发现TopBP1下调的细胞有着非常明显的磷酸化受阻,还观察到伴随着同时下调Claspin并不能造成 Chk1磷酸化信号进一步的衰减。4．在DNA损伤后,TopBP1 与ATR紧密地在损伤处形成小的聚集灶,而Claspin则是同 Chk1类似,迅速地扩展到全细胞核,并不在损伤处聚集。我们观察到了在下调了TopBP1的细胞中仍含有大量的 RPAp32,这是对ATR移动到细胞核损伤灶上一个非常关键的步骤。同样下调了TopBP1未能阻止ATR聚集在DNA损伤处。4．Claspin而不是TopBP1的下调导致了与Chk1受抑类似的表现型,即在Claspin下调后,H2AX的磷酸化在S 期细胞升高,而在TopBP1的下调的细胞则无类似的发现。5． TopBP1而不是Claspin是对复制受阻导致的H2AX磷酸化的主要因素。6．在DNA损伤Claspin与Chk1的结合依赖于 TopBP1。给予诱导下调TopBP1的细胞转染以Flag-Chk1, 转染24小时后给予UV 25J／m2照射。结果显示在TopBP1下调的细胞中Claspin与Chk1的结合显著降低。结论:1． TopBP1是ATR激酶的全激动剂,而Claspin仅作用于ATR 对Chk1的激活。TopBP1对ATR在损伤处的聚集没有影响。 2．FopBP1和Claspin对Chk1激酶有着双重调节作用。3． TopBP1能促进DNA损伤后Claspin与Chk1的结合。4． TopBP1与ATR是相对静止性的蛋白,而Claspin与Chk1是相对动态性的蛋白。