cDNA 微阵列技术也就是基因芯片技术,它是研究在不同条件下的同一细胞、组织、器官中,在肿瘤与正常组织等中的基因转录或表达差异的重要手段。自1995 年Stanford 大学的Schena 和Brown 等发表第一篇基因表达谱芯片(cDNA 微阵列)论文以来,已广泛用于基因功能等的研究。我们利用cDNA 微阵列技术探讨了小鼠受Co-γ线照射后给予小肠 60RNA,其肠组织基因表达谱的改变特点。目的是研究小肠RNA 治疗组与单纯照射组的肠组织基因表达的差异。　 方法:用cDNA 微阵列技术对小肠RNA 治疗组与单纯照射组肠组织mRNA 进行检测。 1.动物分组　　选用第四军医大学实验动物中心繁殖的BALB/c 雄性小鼠12 只。实验前1　wk 实验室常规饲养,随机化分组分为小肠RNA 组与单纯照射组,每组6 只。　　　2.照射条件及给药　　小鼠用戊巴比妥钠麻醉后,固定于带孔的双层塑料照射盒内,放置在与源同高的照射台上,使照射源中心至动物中心距离为1.7m;用Coγ线进行腹部一次照 60射,剂量率为138.82cGy·min-1,剂量为1150cGy,照射总时间的一半后进行半翻身,以保证照射剂量的均匀。照射时除剑突至髂前上棘间区域(称腹部)外,小鼠躯体的其余部位用5cm 厚的铅块屏蔽。小肠RNA 用药组照后2h 内每只动物给予40μg/ml 小鼠小肠RNA　0.2ml。　 3.RNA 抽提与鉴定照后18h 将两组动物脱臼法活杀小鼠,迅速取材编号置液氮保存,采用Trizol 一步法提取总RNA,样品经分光光度计检测吸光度值,并进行热稳定实验,与-20℃和70℃保温1h 后电泳检测28s、18s 条带的变化。两组样品各自合并成2 份样品即小肠RNA 组和单纯照射组 4.mRNA 纯化,探针标记Cy3-dUTP 标记单纯照射组提取的肠RNA,Cy5-dUTP 标记小肠RNA 组提取的肠RNA。芯片制备(型号为M20S, 由上海博星基因芯片有限责任公司提供)包含2304 个基因的cDNA 克隆。杂交与洗涤,室温晾干。检测与分析用General Scanning公司的ScanArray3000 扫描芯片,用ImaGene3.0 软件分析Cy3 和Cy5 荧光信号强度,计算Cy5/Cy3 值,判定基因差异转录的标准:(1)Cy3 和Cy5 信号值两者皆必须大于200,或Cy3 和Cy5 信号值其中之一必须大于800;(2)Cy5/Cy3 大于2 或小于0.5。 结果:各组细胞总RNA 吸光度A260/A280 均大于2;芯片杂交差异结果,标记基因Cy3和Cy5 信号值两者皆必须大于200,或Cy3 和Cy5 信号值其中之一必须大于800 的基因称为有效基因。2304 个目的基因中有2140 个为有效基因。按阳性标准,从2140 个有效目的基因中筛选出差异转录基因共47 条,约占2.2%。在48 条差异基因中,小肠RNA 组与单纯照射组比较,有13 条基因转录增加,34 条基因转录降低。小肠RNA 治疗组照后18h 肠组织中差异表达基因表达增强的居少,仅占差异基因总数27.7%;但同时也有多个基因表达减弱,占差异基因总数72.3%。 讨论以往我们选用BALB/c 小鼠,用局部肠腔扩张注入法,将小肠RNA 引入受腹部照射小鼠体内作实验组,于照后不同时间活杀,取空肠段,采用改进的mRNA 差异展示与消减杂交基础上的LD-PCR技术,分离并克隆了与电离辐射损伤和小肠RNA 促辐射损伤肠腺修复相关差异基因共165 个,其中90 个是与小肠RNA 促辐射损伤肠腺修复相关的差异基因。经中科院上海生化所对其进行全自动测序后,GeneBank 检索结果为:90 个与小肠RNA 促辐射损伤肠腺修复相关基因中20 个与抗体基因同源,35 个与一些已知酶基因同源,18 个新基因序列。上述结果表明,电离辐射对肠腺的辐射损伤和小肠RNA 对辐射损伤肠腺的修复存在基因的改变;小肠RNA 对辐射损伤肠腺的修复作用与某些抗体基因和酶基因的高表达有关。 本实验基因芯片包含2304 个基因中,有癌基因、抑癌基因、细胞因子及受体编码基因、粘附分子相关基因等等,根据47 条差异基因谱分析,结果表明,在分子水平上,有众多的基因参与了肠组织辐射损伤修复过程,通过表达增强或表达降低等途径,作用多个环节,完成着各自的角色,导致受照肠组织病理损伤与修复。结论:在本实验条件下,小肠RNA 导致受照小鼠肠组织基因表达谱中基因表达减弱较多和基因表达增强较少。