血清miRNA作为肾细胞癌无创伤分子诊断标志物的实验和临床研究

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目的:研究血清miRNA作为肾细胞癌分子诊断标志物的可行性及在肾细胞癌发生发展中的可能分子机制。方法:收集肾细胞癌患者以及对照血清样本各132例,同时收集肾细胞癌及癌旁正常组织20对。首先运用低密度芯片技术对25例患者和25例对照分别组成的混合血清中miRNA的表达量进行测定,筛选患者与对照相比表达变化的miRNA,并结合文献检索结果,组成肾细胞癌初筛miRNA;运用qRT-PCR技术对初筛得到的miRNA在42例患者和42例对照中进行复筛,并在65例RCC和65例正常人进行验证,以获得在RCC中稳定降低的一组血清miRNA,并通过ROC曲线评估其临床诊断价值。进一步运用qRT-PCR方法检测miRNA在肾细胞癌及癌旁正常组织的变化,结合生物信息学手段预测血清和组织中变化一致miRNA靶基因,并在体外细胞水平上验证miRNA与靶基因的相互作用。结果:低密度芯片结果显示,131种miRNA在患者与对照之间具有较大差异;运用qRT-PCR技术复筛发现miR-28-5p,miR-378,miR-200a和miR-520c-3p在患者血清中的表达显著下降(变化倍数为1.65~2.97,p<0.0001)。4下降显著miRNA在验证组中变化依然显著(变化倍数为1.69~2.57倍,p<0.0001)。3种miRNA的ROC曲线下面积分别为miR-28-5p(AUC=0.66),miR-378(AUC=0.68),miR-200a(AUC=0.69),miR-520c-3p(AUC=0.65);进一步发现miR-200a在肾细胞癌组织中表达水平显著低于癌旁正常组织;生物信息学预测显示,在肾细胞癌中发挥原癌基因样作用的SPAG9是miR-200a潜在靶基因,荧光素酶实验证实miR-200a可以与SPAG9的3’UTR结合调控其表达;Western blotting结果显示RCC组织中SPAG9与miR-200a表达呈现出负相关,而过表达miR-200a的RCC细胞系中SPAG9表达降低。结论:4种血清miRNA可作为肾细胞癌潜在的生物标志物。肾细胞癌组织中表达下调的miR-200a可能通过对SPAG9的调节参与RCC的发生。对miR-200a与肾细胞癌关系深入研究可为肾细胞癌的诊断和治疗提供新方法和新思路。
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