DNA分子克隆技术是分子生物学研究的基础,其创新和发展直接推动着分子生物学的进步。目前使用的分子克隆方法主要有4类:1.传统的酶切-连接法;2. Gateway特异位点重组克隆;3. Golden Gate克隆;4.重叠序列拼接,包括Gibson拼接和In-Fusion等。其中,酶切-连接法受DNA内部相应位点的限制,并且多片段克隆难度大;Gateway克隆试剂昂贵,多片段克隆效率低,不能无缝克隆;Golden Gate克隆使用IIs型限制性内切酶的识别位点一般为6-7个碱基,在DNA中出现频率较高,使用受限;而以Gibson为代表的重叠序列拼接法不受DNA序列限制,并可多片段拼接和无缝克隆,因此使用越来越广泛。但是Gibson克隆一般使用基于酶切-连接法的载体,该类载体众多,克隆位点序列各异,尚未形成一个统一的系统。并且Gibson克隆需要先将目标载体线性化处理,没有Gateway和Golden Gate直接使用环状载体快捷和方便。后基因组时代需要进行大量的基因功能研究,需要构建大量表达载体,因此有必要建立一个快捷、高效、可标准化操作的分子克隆系统。并且目前使用的分子克隆均为国外技术,试剂盒价格昂贵,在我国分子生物学快速发展的形式下,也急需研发一种国产分子克隆技术。因此,我们开发了一种新型的标准化分子克隆技术──Nimble Cloning,该系统目标载体的克隆位点处设计有通用接头-SfiI-ccdB-SfiI-通用接头的结构,带有20bp通用接头序列的目标DNA直接与环状目标载体混合,在SfiI限制性内切酶和T5核酸外切酶混合反应液作用下完成克隆。其克隆反应原理为:由SfiI切开环状载体,T5核酸外切酶在线性DNA两端沿5’-3’方向进行消化,目标基因和载体两端由于设计有重叠序列,消化后露出的互补DNA单链能够结合,转化大肠杆菌后即可获得重组克隆。Nimble Cloning具有以下优点:1.直接将DNA克隆到环状载体。直接使用环状载体可避免载体的线性化酶切和回收等步骤,简化了实验操作,还提高了克隆效率。2.使用灵活,用途广泛。PCR产物和环状质粒上的DNA(入门克隆)均可克隆到目标载体,并且可用于单片段、多片段和多位点等多种形式的克隆。3.试剂成本低,只需SfiI和T5核酸外切酶2种常规酶。4.可灵活用于标准化克隆和无缝克隆。基因加带通用接头序列后可克隆到系统任何一个载体,形成一个标准化的克隆系统。如有不使用通用接头序列的无缝克隆要求,只需将目标基因与载体的重叠序列设计在通用接头序列的外围,不重叠的通用接头序列可由T5核酸外切酶消化去除,在不改变载体的情况下实现无缝克隆。为了方便NimbleCloning技术的推广使用,我们构建了一系列配套的系统表达载体,包括原核表达、酵母双杂交、植物超表达、植物RNAi、植物BiFC、哺乳动物表达载体等,初步形成了一个标准化的克隆系统,为基因功能研究提供了一个便利的平台。