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目的:慢性硬膜下血肿患者血肿液中含有大量炎症及促血管生成因子,但其来源及合成调控机制尚不清楚。钻孔引流术是CSDH一线治疗方案,但由于术后复发率高、老年人基础病多和抗凝药物的广泛使用等原因导致部分病人预后较差,药物保守疗法越来越受到人们关注,阿托伐他汀是目前唯一获得I级循证医学证据的药物治疗方案,有望成为CSDH治疗的一线方案,但仍有11.2%病人对该疗法无应答需转手术治疗,且单纯阿托伐他汀治疗需持续8周甚至更久,仍需进一步优化药物治疗方案。外泌体是直径为30-150nm的小囊泡,广泛存在于血液、尿液以及脑脊液等多种体液中,介导细胞间的信号传递,然而血肿液中是否存在外泌体及其功能尚不清楚。本研究分基础实验和临床试验两部分,基础实验部分拟探明血肿液是否存在外泌体,比较血肿液外泌体与血液外泌体miRNA的差异,并初步探索其对SDH大鼠的影响及对血管生成的调控,进一步加深对CSDH发病机制的理解,临床试验部分将比较单用阿托伐他汀与阿托伐他汀联合地塞米松疗法对CSDH的治疗效果以及对血管生成和炎症反应的调控作用,为进一步优化CSDH药物诊疗方案提供新思路。方法:基础研究部分:(1)收集慢性硬膜下血肿患者血肿液,利用超速离心法处理血肿液上清,借助Western Blot、透射电镜及纳米颗粒示踪仪鉴定血肿液上清经超速离心法所得颗粒;(2)构建大鼠急性硬膜下血肿模型,借助MRI及mNSS评分评估血肿外泌体对急性硬膜下血肿大鼠神经功能及血肿大小的影响;(3)利用PKH26试剂盒以及细胞免疫荧光技术观察HUVEC对血肿外泌体的内吞;(4)分别用CSDH病人血清及血肿液外泌体干预人脐带血内皮细胞(HUVEC),通过细胞因子芯片、PCR及成管实验评价血肿外泌体对HUVEC成管实验、通透性及血管生成相关细胞因子的影响;(5)借助ELISA技术检测正常对照血清、CSDH病人血清以及CSDH病人血肿中ANG-1和ANG-2浓度,并比较对应病人及志愿者外周血实验室检查结果;(6)借助高通量miRNA测序比较正常人血清、慢性硬膜下血肿病血清及血肿液miRNA的差异,并利用RT-PCR验证差异表达基因;(7)借助RT-PCR验证血肿外泌体对HUVEC细胞内mir-144-5p的影响;(8)借助siRNA-mate转染试剂盒及mir-144-5p类似物过表达HUVEC细胞内mir-144-5p,通过成管实验、血管通透性实验、WB以及PCR研究mir-144-5p对HUVEC成管实验、通透性以及ANG-1/ANG-2的影响;临床试验部分:通过志愿者招募及筛选,借助影像学检查、MGS-GCS以及ADL-BI等神经功能评分,前瞻性性研究阿托伐他汀联合地塞米松对CSDH病人血肿吸收及神经功能的影响,同时利用流式细胞术检测外周血内皮祖细胞和T淋巴细胞亚群的改变。结果:基础研究部分:(1)慢性硬膜下血肿患者血肿液中存在外泌体,广泛表达外泌体表面标志物CD9、CD63及TSG101,粒径集中在30-100nm范围内,波峰处颗粒直径为74nm;(2)血肿外泌体抑制SDH大鼠血肿吸收,加重神经功能缺陷;(3)HUVEC可内吞血肿外泌体;(4)血肿外泌体干预导致HUVEC成管增多、血管生成相关细胞因子血管紧张素-2(Angiotensin-2),表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF),重组人细胞膜糖蛋白(Endoglin)及CXCL4增多,同时显著增加细胞内ANG-2 mRNA,降低ANG-1 mRNA;(5)健康对照组与CSDH患者年龄、性别等基本资料以及血常规、肝肾功能等外周血化验无差异,CSDH患者血清和健康对照组ANG-1和ANG-2浓度无显著统计学差异,而CSDH患者血肿液中ANG-1含量显著降低,而ANG-2含量显著升高;(6)患者血清外泌体与正常对照血清外泌体miRNA未见明显差异,CSDH血肿液外泌体miRNA大部分与血清外泌体一致,差异基因主要参与初级胆汁酸代谢、terpenoid backbone biosynthesis pathway、过氧化物酶体增殖物活化受体信号通路、肾素血管紧张素系统、酮体合成和降解、类固醇激素生物合成、细胞内吞、Hippo信号传导途径以及AGE-RAGE信号通路等,血肿液外泌体显著富集mir-144-5p和mir-21-5p;(7)血肿外泌体干预HUVEC可显著提高细胞内mir-144-5p含量;(8)过表达mir-144-5p可导HUVEC细胞成管增多,通透性增加,同时伴随着ANG-1含量下调以及ANG-2含量增加;临床试验部分:本研究共纳入60例慢性硬膜下血肿患者,30例被随机分配至阿托伐他汀治疗组,另外30例则被随机分配至阿托伐他汀联合地塞米松组。两组患者入组时年龄、性别等基本流行病学特征无显著统计学差异,治疗后2周和5周时,联合治疗组血肿减少量显著高于单纯他汀组(分别为2周时23.11±15.37 vs.7.02±13.06 mL,p<0.0001;5周时43.27±19.09 vs.24.23±25.17mL,p=0.0017),5周时联合治疗组MGS-GCS评级为0的患者比例显著多高于单纯他汀组(83.33%vs 32.14%,p=0.0004),提示更好的神经功能改善。阿托伐他汀治疗组有4(13.3%)例患者因血肿增大或症状加重转手术治疗(分别在入组后14、16、40或48天),而联合治疗组有1例病人(3.3%)在治疗48天后转手术治疗(p=0.161)。联合用药组较单纯阿托伐他汀治疗组显著提高外周血EPC和Treg数量,降低CD4+T淋巴细胞数,两组病人CD8+T淋巴细胞和CD19+B细胞无统计学差异。两组病人外周血化验未见红细胞、白细胞、白细胞分类以及血小板血红蛋白等差异,两组病人均无感染、消化道出血以及肌溶解等严重并发症。结论:(1)CSDH血肿液存在外泌体,该外泌体可加重SDH大鼠神经功能缺陷,抑制血肿吸收;体外实验表明血肿外泌体可被HUVEC细胞内吞,促进HUVEC成管增多、ANG-2增多及ANG-1下降;(2)健康对照组与CSDH患者血清外泌体miRNA无明显差异,血肿外泌体富含mir-144-5p,过表达mir-144-5p可复制血肿外泌体对HUVEC血管生成以及ANG-1/ANG-2的影响,这表明血肿外泌体可能通过过将mir-144-5p传送至HUVEC,引起ANG-1含量下调以及ANG-2含量增加,进而导致成管增多,通透性增加,引起反复出血和新生血管渗出增加,血肿不断增大;(3)联合阿托伐他汀和小剂量地塞米松可促进血肿吸收和神经功能改善,其疗效优于单纯阿托伐他汀治疗,可能与联合用药显著改善血管生成和抑制免疫炎症反应有关。