目的构建结核分枝杆菌Ag85A蛋白的分枝杆菌表达质粒,并研究其在耻垢分枝杆菌中的表达。方法采用PCR方法自结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增Ag85A基因片段,克隆至pGEM-T载体,PCR筛选阳性克隆并酶切鉴定后测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至穿梭载体pBCG3000,构建pBCG3000—Ag85A重组质粒,将其转化入大肠杆菌DH5α;PCR和双酶切鉴定转化菌落;扩大培养阳性转化菌株,提取重组质粒pBCG3000—Ag85A,并将其转化耻垢杆菌;PCR鉴定转化菌落;将阳性菌株经热诱导,SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85A基因片段,成功构建重组表达质粒pBCG3000—Ag85A,SDS—PAGE显示表达产物分子量约为32kD,且能被结核病人血清识别。结论成功构建pBCG3000—Ag85A重组分枝杆菌表达质粒,该质粒可在耻垢杆菌中表达Ag85A蛋白,为结核病疫苗的研究奠定了基础。