Vero细胞DNA定量国家参考品的制备及适用性验证

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目的:制备Vero细胞DNA参考品,使宿主DNA残留量检测中的斑点杂交试验操作进一步标准化。方法 :提取Vero细胞基因组DNA,并采用Hind III酶切,克隆、测序进行鉴定。之后由10家实验室协作标定DNA浓度,稀配至40ng/mL,以牛血清白蛋白作为冻干赋形剂,安瓶分装,装量为0.5mL,充氮气后熔封。制备完成后由10家实验室进行灵敏度,线性和稳定性验证。结果 :制备了一批Vero细胞DNA,Hind III酶切,琼脂电泳可见典型172bp梯度条带,获得重组质粒pET30a-172,测序后与Genbank序列比对同源性为99.4%。Vero细胞DNA参考品原液协作标定浓度为64.0±1.9μg/mL,OD.260/OD.280=1.9,Vero细胞DNA参考品灵敏性为1~5pg/dot,最高可达1pg/dot,浓度与斑点显色成比例,具有良好线性,37℃放置2周,4周后与-20℃常规保存下的同步试验,灵敏度一致,结果显示稳定性良好。结论 :成功建立适用于斑点杂交用的Vero细胞DNA定量参考品,该参考品的建立对疫苗宿主DNA残留检测的斑点杂交方法的标准化具有重要的理论是实际应用价值。
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