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目的拟采用斑马鱼选择最常见的肝毒性为研究的切入点,目标是建成符合GLP规范的药物早期毒性筛选体系。方法 （1）建立斑马鱼饲养系统:选用背景清晰的AB-line,根据GB/T13267-g1和《Zebrafish Book》建立斑马鱼饲养体系。（2）斑马鱼毒性筛选方法的研究。浓度-毒性关系研究:参照GB/T13267-91,采用换水法,从预试验中选择0%和100%浓度,以几何比做间距,至少选择5个浓度为正式实验的浓度。时间-毒性关系研究:选择合适的浓度研究0,6,12,24,48,72和96 h的一般观察、死亡率和病理学变化。病理学检查方法研究:采用单尾斑马鱼固定,进行腹部横切和纵切以及采用多尾斑马鱼肝脏共同固定包埋,进行切片观察。生化指标检测方法研究:取斑马鱼肝脏,按照生理盐水1:99和1:199进行组织匀浆,采用生化分析仪检测。早期标志物研究:采用Elisa法检测肝组织α-GST,Arg I,ASAL,PA,XOD,ICD,SDH,OCT采用生化分析仪检测TBA的变化。microRNA研究:采用基因测序法研究microRNA的变化,并预测斑马鱼新的microRNA。（3）采用工具药物APAP验证:采用以上研究方法,对APAP进行毒性特点验证。（4）对创新药物苯胺洛芬进行评价:采用以上研究方法对苯胺洛芬进行评价,发现苯胺洛芬斑马鱼肝毒性特点。结果 （1）建立了稳定的斑马鱼饲养系统,斑马鱼饲养水为标准稀释水pH值为7.8±0.2,硬度为250 mg·L-1,饲养温度为23～28℃,采用人工饲料结合多种饵料投喂,以所有饲料可5 min内吃完为好。斑马鱼用于试验时成体长3～4 cm。（2）建立了斑马鱼药物预试验方法和浓度-毒性研究方法、时间-毒性研究方法,建立了斑马鱼病理学检查方法。①解剖显微镜观察方法:将斑马鱼捞出置培养皿中,从鱼鳍侧面沿鱼嘴处向下剖开鱼腹,暴露鱼的肝肠,将培养皿置于解剖显微镜载物台中央,调整焦距,观察拍照。②HE法:将7～10个斑马鱼肝脏取出,固定,同时置于一个包埋盒中进行包埋,HE染色观察。每个肝脏均可以完整的观察。建立了斑马鱼肝脏病理组织学背景数据图谱。生化指标检测:以1:99制备组织匀浆液检测为宜。检测了正常斑马鱼的ALT,AST,ALP,GGT,CK。确立了早期标志物和microRNA的研究方法。（3）工具药APAP验证结果:浓度-毒性关系:APAP浓度为1,2,4,8,16 mmol·L～,LC50为5.77 mmol·L-1。浓度大于4 mmol·L-1,斑马鱼脏颜色变深,质地疏松,肝脏结构不清,肝细胞轻度至中度空泡变性,肝组织多处点灶性坏死。时间-毒性关系:1,2 mmol·L-1组斑马鱼96 h病理改变不明显,4 mmol·L-148 h开始出现明显病理改变,8,16 mmol·L-1组早期病理已出现明显改变。生化指标:ALT给药后48 h升高显著,AST,CK随着给药时间的推移也逐渐升高。早期生物标志物:Arg,ASL和TBA在给药12 h出现变化,变化早于其余的标志物,可能是APAP致斑马鱼肝损伤的早期标志物的敏感指标。microRNA（4）对创新药物苯胺洛芬进行评价:浓度-毒性关系:Binaprofen 0,100,140,196,274,384,537 mg·L-1,LC50为304.4 mg·L-1。浓度大于196 mg·L-1斑马鱼肝细胞空泡样变,肝组织结构紊乱。时间-毒性关系:100 mg·L-196 h变化不明显,274 mg·L-1早期变化不明显,96 h病理改变明显,537 mg·L-1早期就出现了明显改变。生化指标:ALT给药后48 h升高显著,AST,CK随着给药时间的推移也逐渐升高,但没有显著性差异。早期生物标志物:ASL,OCT和TBA在给药12 h出现变化,变化早于其余的标志物,可能是Binaprofen致斑马鱼肝损伤的敏感早期标志物。结论本研究建立了斑马鱼早期肝毒性筛选方法和技术体系,工具药物APAP毒性特点与文献报道一致,并对创新药物苯胺洛芬评价,得出了苯胺洛芬斑马鱼肝毒性特点,建立了系列SOP,斑马鱼肝毒性早期筛选技术体系基本建立。