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研究目的:肌腱损伤是体育运动和日常生活中常见的运动性疾病,影响人体机能水平和运动能力的发挥。由于肌腱损伤的病理机制尚不清楚,治疗主要针对症状且疗效欠佳。干细胞(Stem Cell),在生物界又被称为"万能细胞",具有自我更新能力、多向分化潜能和再生各种组织器官的能力。肌腱源性干细胞(Tendon-derived stem cells,TDSCs)在肌腱再生和修复中具有重要意义。本研究通过体外分离培养跟腱来源肌腱干细胞并对其进行生物学特性分析,建立小鼠肌腱损伤模型,通过将TDSCs移植到肌腱损伤部位后评估了TDSCs促进损伤肌腱修复的可行性。研究方法:本研究以4周龄SD大鼠跟腱组织为材料,采用I型胶原酶和中性蛋白酶II联合消化法分离大鼠跟腱来源肌腱干细胞。通过RT-PCR,细胞免疫荧光、流式分析、生长曲线、克隆形成能力、多分化体系诱导等实验对细胞进行生物学特性进行研究。本研究选取56只6周龄雄性ICR小鼠,实验前按照0.05mL/10g体重的剂量注射0.25mg/mL的环保霉素A,连续注射10d,正常对照组(ControlGroup,CG)小鼠14只,其余42只采用胶原酶I(0.015mg/μL,20μL)诱导肌腱损伤模型,随机分为肌腱干细胞治疗组(TDSCs group)、生理盐水治疗组(Saline Group,SG)和损伤后自修复组(Injured Gourp,IG)。分别在损伤诱导后24 h后进行TDSCs移植、0.9%生理盐水注射和损伤后不做任何处理。在治疗后1d、3d、5d、7d、21d、28d和42d各处死两只小鼠分别进行眼球部位采血和肌腱组织取材制作石蜡切片和冰冻切片,通过免疫组织化学和病理切片等对TDSCs的治疗效果进行系统评估。研究结果:采用I型胶原酶和中性蛋白酶联合消化法分离的细胞,分别通过RT-PCR和细胞免疫荧光等方法进行鉴定,结果显示,体外分离培养的细胞能够表达干细胞特异性标记Nucleostemin和Nanog以及肌腱特异性标记CollagenⅠ,CollagenⅢ,Tenascin-C,Scleraxis和Tenomodulin,且流式细胞分析结果显示表达上述抗体的细胞阳性率均达到93%以上,表明所分离的细胞是TDSCs。TDSCs在体外可传代至P15,分别取P4、P9和P13 TDSCs绘制生长曲线、细胞克隆形成能力和多分化潜能的研究结果显示,P4和P9代细胞的细胞倍增时间(PDT)分别为29.41h和26.17h,明显少于P13代细胞(49.7)(P<0.05);P4和P9的克隆形成率分别为(37.73%±0.21%)和(42.06%±0.61%),显著高于P13(20.14%±0.48%)代细胞((P<0.05));与P13代细胞相比,P4和P9代细胞在体外更容易被诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞,形成钙化结节,矿物质沉积和脂滴,能够分别被茜素红S、阿利新兰染色液和油红O染色,RT-PCR检测诱导后细胞分别表达成骨细胞特异性标记基因(OPN,Runx2和bALP)、成软骨细胞特异性标记基因(ACAN和Sox9)和脂肪细胞特异性基因(LPL和PPAR-γ),表明TDSCs在体外具有自我更新、增殖和多向分化潜能。通过I型胶原酶诱导小鼠肌腱损伤模型,组织病理学研究结果显示,肌腱胶原纤维排列紊乱,肌腱基质严重破坏,炎性细胞浸润明显增多形成了炎性细胞带,肌腱结构的完整性被破坏。TDSCs移植后通过冰冻切片对CM-Dil细胞失踪剂标记的移植细胞进行示踪检测,激光共聚焦显微镜下观察移植后细胞定位于受损组织的区域;组织病理切片观察发现,与IG和SG相比,TDSCs治疗组的肌腱病理状况明显得到缓解,炎性带面积减小,且在TDSCs移植后21d肌腱结构明显恢复;免疫组织化学结果显示,TDSCs移植5d后,TDSCs group细胞增殖因子Ki-67蛋白的表达数目和表达强度明显高于其它组(P<0.05),而凋亡蛋白caspase-3蛋白的表达强度逐渐减弱(P<0.05),且干细胞特异性蛋白Nucleostemin和Nanog表达强度逐渐减弱,与腱细胞相关蛋白(CollagenⅠ,TNC和Scx))表达强度呈负相关,表明TDSCs移植到损伤部位发生增殖并向腱细胞分化参与损伤组织的修复。研究结论:体外分离培养的大鼠跟腱来源TDSCs具有自我更新和多分化潜能;通过TDSCs的体外移植,证明了TDSCs在一定程度上参与并促进了损伤肌腱的再生和修复。