大豆是食用油和植物蛋白的主要来源,并可通过结瘤固氮促进减肥增效,是我国重要的经济作物。大豆为古源四倍体,约75%的基因存在冗余性,这导致化学诱变、转座子插入等传统突变体筛选手段的突变表型效率低。这一瓶颈严重制约大豆基因功能研究,也影响了遗传改良工作。CRISPR/Cas9介导的基因编辑具有设计简单、克隆方便、编辑高效等优点,尤其是单个sgRNA可以同时靶向多个高度同源的位点,导致多基因突变。如果能构建大规模的CRISPR/Cas9多基因敲除突变体库,将有效克服基因冗余,促进大豆分子遗传研究。但该技术在大豆运用尚存在缺乏高通量载体、遗传转化效率偏低、基因编辑效率不稳定等瓶颈。本研究首先对载体开展一系列改造,开发具有高通量克隆、高编辑效率等特点的大豆基因编辑载体pGEL201。在此基础上,我们又对PAM识别范围、T-DNA分离筛选标记等方面进行改进,形成一系列满足高通量基因编辑研究不同需求的载体工具。我们随后运用大豆高效遗传转化体系,并针对sgRNA设计、载体混池、转化子鉴定、基因编辑检测等流程优化,初步建立大豆高通量基因编辑体系。目前本研究已获得定向覆盖上百个基因的大豆多基因编辑群体,每个载体均可鉴定到多个转化株系,其中部分株系已经获得稳定遗传的T1或T2纯合突变。运用本群体,我们针对大豆碳氮代谢、结瘤固氮、种子品质等性状进行基因功能挖掘,并创制超结瘤"绿肥型"大豆等具备应用潜力的基因编辑大豆种质。本研究表明,大豆高通量多基因编辑群体的构建具备可行性,将可为大豆遗传学研究及基因改良提供有价值的材料。