羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株铁应答调控因子irr和rirA基因缺失株的构建与鉴定

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为了揭示羊种布鲁氏菌铁调控因子irr和rir A基因的功能及其在布鲁氏菌病发病机制中的作用。用M5-90作为亲本株,利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因分别替换irr和rir A基因,获得缺失株M5-90Δirr和M5-90Δrir A;将亲本株和缺失株分别在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势;利用抑菌圈法检测各菌株对不同抗生素的敏感程度;将各菌株置于10m M H2O2的氧化环境下进行培养,检测其对H2O2的敏感性变化;将各菌株感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁氏菌铁应答调控因子irr和rir A基因缺失株且20代内未发生回复性突变;与亲本株相比,缺失株Δirr和Δrir A在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,但其总体浓度低于亲本株,进一步证实了irr和rir A参与了布鲁氏菌的生长繁殖过程;药敏试验显示,irr和rir A基因缺失后对相应抗生素的敏感程度有所增加,但对新霉素的敏感性消失;体外应激环境中的存活试验显示,irr和rir A基因缺失后在强酸、强碱、高盐、热休克应激环境中的生存率降低程度各有不同,但在H2O2氧化环境下的生存率高于亲本株;黏附侵袭试验显示,在感染15min、45min和60min时,缺失株Δirr和Δrir A对RAW264.7的黏附侵袭能力显著低于亲本株M5-90,首次发现irr和rir A基因缺失后导致细菌对宿主细胞的粘附侵袭能力有所降低,irr和rir A基因不仅与细菌铁离子代谢相关,还参与了布鲁氏菌入侵宿主细胞的生物学过程;胞内生存试验发现,缺失株Δirr、Δrir A在RAW264.7细胞内的存活能力相比于亲本株M5-90均有所增强,感染巨噬细胞24小时后,缺失株Δirr和Δrir A的细胞内存活能力显著高于亲本株M5-90,说明irr与rir A基因的缺失能使羊种布鲁氏菌在其宿主细胞内更快地建立生态位,而根据本研究结果,缺失株Δirr和Δrir A能够比亲本株更快建立生态位的优势可能与其抗氧化应激作用有关。这些结果表明,铁应答调控因子irr和rir A基因参与了羊种布鲁氏菌的生存繁殖过程,并调控着羊种布鲁氏菌的毒力与致病作用。
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