堆型艾美耳球虫(Eimer ia acervulina)北京株α-微管蛋白基因的克隆和表达

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采用组织提取法提取堆型艾美耳球虫(E.acervulina)北京株的RNA,以其为模板,参考GenBank 上E.acervulina 的α-微管蛋白基因序列,设计合成特异性引物,对E.acervulina北京株RNA 进行RT-PCR.1%琼脂糖电泳表明所得基因片段的大小为1950bp 左右。回收该片段,将其与pGE?-T 连接,转化致大肠杆菌DH5 α中。用蓝白斑筛选阳性克隆,碱裂解法提取质粒,经限制性内切酶BamH I/EcoR I 双酶切及PCR 鉴定正确后,进行序列测定。序列分析显示,克隆后所得基因与GenBank 上登录的E.acervulina 的α-微管蛋白的基因相比,二者的同源性达到97.4%。以测序质粒为模板,重新设计表达引物,克隆α-微管蛋白基因的阅读框基因片断(不包含疏水区),并与表达载体pGEX-6P-1相连接,转化致大肠杆茵BL21(DE3)中,1mM IPTG 诱导,SDS-PAGE电泳结果表明表达蛋白的大小为69kDa,诱导后5h 蛋白表达量即达到高逢。用GST 抗体进行Western-blot 检测,在69kDa 处检测到目的条带。
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