论文部分内容阅读
目的利用非小细胞肺癌细胞研究对奥西替尼潜在耐药基因。方法首先利用CRISPR-Cas9全基因组文库在人非小细胞肺癌细胞NCI-H1975中筛选出奥西替尼潜在耐药铁氧还蛋白1(FDX1)基因,建立敲除FDX1和对照AAVS1表达的sg-FDX1及sg-AAVS1稳定细胞系。提取sg-FDX1细胞基因组并且PCR扩增出sgRNA序列两侧的DNA序列,连接到T载体后进行测序;Western-blot检测sg-FDX1和sg-AAVS1细胞中FDX1蛋白表达水平;将构建的sgFDX1和sg-AAVS1细胞分别用不同浓度奥西替尼培养30 h后,Western印迹法检测细胞中c-PARP蛋白表达水平以及EGFR和ERK磷酸化水平。采用平板克隆和CCK8实验检测肿瘤细胞的存活率。结果测序结果表明,sg-FDX1细胞中的FDX1基因发生缺失,同时FDX1蛋白表达水平被有效抑制;和sg-AAVS1细胞相比,50 nmol·L-1奥西替尼处理后的sg-FDX1细胞中c-PARP表达水平显著降低(P<0.01);奥西替尼在sg-FDX1细胞中对p-EGFR和p-ERK蛋白表达抑制作用相对于sg-AAVS1细胞显著降低(P<0.01)。克隆形成和CCK8实验表明,相对于sg-AAVS1细胞,奥西替尼对sg-FDX1细胞的克隆形成率和增殖抑制作用显著降低(P<0.05)。结论 NCI-H1975细胞敲除FDX1,减弱了奥西替尼对细胞凋亡的诱导功能,可能是FDX1参与NCI-H1975细胞对奥西替尼耐药机制之一。