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目的:研究活血胶囊含药血清对小鼠血管内皮细胞（vascular endothelial cell, VEC）的抗炎和抗氧化作用。方法:制备大鼠含药血清,用WST-1法检测含药血清对细胞活力的影响;TNFa 30 ng/mL诱导VEC,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测含药血清对细胞间黏附分子（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）和炎性受体LOX-1 （lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1）表达的影响,并分析含药血清对NF-kB信号通路的抑制作用及机制;以H2O2诱导细胞损伤,检测含药血清对细胞活力、细胞总抗氧化能力和活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生的抑制作用。结果:1含药血清对VEC细胞活力的影响检测不同浓度含药血清处理24 h对细胞活力的影响,结果如图1所示,含药血清在2.5%、5%和10%浓度对细胞活力无影响,但在20%浓度时可能引起细胞活力显著降低。2含药血清抑制TNFα诱导的ICAM-1和LOX-1表达上调30ng/mL TNFa处理VEC 6 h可诱导细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）和参与胆固醇转运的凝集素样氧化低密度脂蛋白受体（lectin-like oxidized LDL receptor-1,Lox-1）的mRNA表达显著上调,应用10%含药血清预处理细胞24 h可抑制TNFα的调控作用（P＜0.01）。含药血清单独应用对ICAM-1和Lox-1 mRNA表达无显著影响。图2B显示, 10%含药血清预处理24 h可显著抑制细胞中TNFα作用6 h诱导的ICAM-1和LOX-1蛋白表达上调,与其对基因表达的调控作用相一致。3含药血清抑制TNFα诱导的经典NF-kB信号通路激活通过检测TNFα诱导的IkBa蛋白降解来研究经典NF-kB信号通路的激活。TNFα30ng/mL作用30 min可诱导细胞中IkBa蛋白水平下降,表明发生了降解。10%含药血清预处理24 h可显著抑制TNFα诱导的IkBa蛋白降解（P＜0.01）,提示经典NF-kB信号通路激活受到抑制。4PI3K/AKT信号通路参与介导活血胶囊的作用与含药血清+TNFα组相比,PI3K抑制剂LY294002 （LY,50 mM）和Wortmannin（Wort,500 nM）可显著阻断含药血清对TNFR1/IkBa信号的抑制作用（P＜0.01）,提示PI3K/AKT信号通路参与介导含药血清的作用。5含药血清对H2O2诱导细胞氧化应激损伤的保护作用H2O2可呈浓度依赖性诱导VEC细胞活力降低,表明发生氧化损伤, 100 mM H2O2作用3h可使细胞活力明显减低,约为对照组的40%（P＜0.01）,含药血清预处理24 h可显著减轻H2O2对细胞活力的影响（P＜0.01）,但未能恢复到对照水平。200 mM H2O2可使细胞活力减低至约为对照组的20%（P＜0.01）,此时含药血清不能减轻H2O2的作用。图5B显示,不同浓度含药血清作用24 h,可增强细胞的总抗氧化能力（Ab734值越低代表抗氧化能力越强）,10%含药血清的作用具有统计学显著性（P＜0.05）,2.5%和5%含药血清也具有一定作用。图5C、D显示, 100 mM H2O2作用3 h可诱导细胞内ROS含量显著,10%含药血清则可显著降低H2O2诱导的细胞内ROS产生。结论:现代医学研究显示,慢性炎性反应和氧化应激损伤是引起包括冠心病、阿尔茨海默症、骨质疏松等在内的多种老年性疾病的主要原因[4, 5]。TNFα是体内最为重要的炎性细胞因子之一,在大血管和微血管循环的破坏中起关键作用,对于神经细胞和成骨细胞也发挥直接调控作用。在循环系统,TNFα不仅可激活经典NF-kB信号通路而诱导ICAM-1等黏附因子表达上调而介导VEC功能失调,也可通过促进LOX-1表达而加强细胞对氧化型低密度脂蛋白（oxidizedlow density lipoprotein,oxLDL）的摄取,造成细胞氧化损伤,或诱导泡沫细胞形成,后期还通过调控基质金属蛋白酶MMPs的表达和活性而影响动脉粥样斑块稳定性[6]。TNFα的这些作用均主要通过与细胞膜上其特异性受体TNFR1结合而达成。我们研究结果显示,活血胶囊含药血清可抑制VEC中TNFR1/IkBα/NF-kB信号通路的激活,从而抑制下游分子ICAM-1和LOX-1的表达,抑制内皮功能失调和动脉粥样硬化过程的启动。此外,研究还表明PI3K/AKT信号通路参与介导活血胶囊的作用。含药血清还可通过增强VEC细胞的总抗氧化能力和抑制细胞中ROS的产生,从而抑制H2O2引起的氧化损伤。尽管活血胶囊含药血清发挥抗炎和抗氧化作用的相关分子机制尚有待进一步深入研究,本实验仍为活血化瘀中药通过多途径、多环节、多靶点发挥干预作用[7],对冠心病发挥预防和治疗作用提供了细胞水平的直接实验室证据。