论文部分内容阅读
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎。更重要的是,该菌的先期感染易于导致其它多种病原的继发感染,加重病情造成较严重损失。百日咳杆菌黏附素是由Bbprn基因编码的一种重要的黏附因子,被认为是Bb最主要的保护性抗原。本研究克隆了猪源Bb强毒株HH0809的prn基因,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统在大肠杆菌中进行了融合表达。克隆基因的核苷酸和氨基酸序列与GeneBank已经提交的所有猪源Bb的prn序列均具有98%以上的同源性。利用ProtParam软件对融合表达蛋白的理化性质进行预测分析,结果显示不稳定系数为38.33,属于稳定型蛋白质。SDS-PAGE和Western blot检测证实该基因获得高效表达并具有良好的免疫学活性。经GST融合蛋白纯化试剂Glutathione SepharoseTM4B纯化后,得到浓度为207.3μg/mL、纯度为90.1%的融合蛋白GST-PRN。在小鼠免疫保护力试验中,重组蛋白免疫组BalB/C小鼠能够抵抗3.2×LD50量的Bb强毒株HH0809的呼吸道气雾攻击,保护率为100%(20/20),而GST载体蛋白对照组和PBS空白对照组的小鼠分别存活了4只和3只。这证明原核表达的PRN蛋白具有天然PRN外膜蛋白的免疫效力,可考虑作为新型疫苗或疫苗添加成分。通过凝血酶Thrombin酶切融合表达产物GST-PRN并回收,获得纯度为93.1%、浓度为120.5μg/mL的不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段。以PRN蛋白片段为抗原建立检测百日咳杆菌黏附素抗体的间接ELISA方法。方阵滴定结果显示,血清最佳稀释度为1:40,PRN抗原最佳稀释度为1:320(43.9μg/孔)。阴阳性临界点为0.335。重复实验中变异系数最大为7.83%,最小为3.51%。猪巴氏杆菌病、猪大肠杆菌病、仔猪副伤寒、猪传染性胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪气喘病阳性血清和5份猪波氏菌病阴性血清用ELISA检测都呈阴性。ELISA方法对2份接种了猪波氏菌病灭活菌苗的猪血清和2份Bb感染猪血清的检测结果均为阳性。敏感性试验表明,该ELISA方法的敏感性比本实验室已经建立的乳胶凝集试验方法高4～128倍;该ELISA方法能够检测到人工感染Bb仔猪14d的血清抗体IgG。该ELISA方法对临床送检的1229份猪血清的检测阳性率为32.7%。同时,该方法对湖北2个阳性猪场各年龄段猪群的临床监测结果表明,生长前期(36～55日龄)和育肥期(56～90日龄)猪群的阳性率明显高于断奶前(15～21日龄)和保育期(22～35日龄)猪群。本研究建立的PRN抗体监测ELISA方法具有较好的重复性、特异性和敏感性,有望成为一种准确、快速和实用的猪波氏菌病血清学诊断方法。