【摘 要】
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目的建立同时检测人多瘤病毒(BKV)和巨细胞病毒(CMV)载量的实时定量荧光PCR技术(FQ-PCR),并探讨其在肾移植术后感染监测中的应用。方法选择BKV和CMV核酸保守性序列作为靶基因
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目的建立同时检测人多瘤病毒(BKV)和巨细胞病毒(CMV)载量的实时定量荧光PCR技术(FQ-PCR),并探讨其在肾移植术后感染监测中的应用。方法选择BKV和CMV核酸保守性序列作为靶基因,PCR扩增靶片段与质粒pcDNA3.1(+)连接。通过测序技术对进行克隆筛选。提取质粒并采用10倍梯度稀释(5×103~107拷贝/ml)作为BKV和CMV核酸序列的标准品,并评价其灵敏度;采用对比正常人DNA、BKV阳性质控和CMV阳性质控评价其特异性;通过对标准品DNA分别进行批内和批间各20次重复实验,以其循环阈值(Ct)的变异系数(CV)评价其精密度。对480例肾移植受者外周血样本,进行FQ-PCR检测BKV和CMVDNA拷贝数,检测FK506血药浓度,并对两者进行相关性分析。结果重组质粒经测序检测显示含有靶BKV和CMV核酸序列。所建立的FQ-PCR方法,其最低检测下限均为5.0×103copy/mL的DNA标准品。正常人DNA的BKV和CMV拷贝数检测为阴性,而阳性对照能够发现荧光值显著变化,证实为针对靶DNA的特异性扩增;重复性检测显示批内差异分别为3.44%(BKV)和2.23%(CMV),批间差异分别为4.98%(BKV)和3.76%(CMV)。(3)肾移植患者CMV感染的阳性率为27.08%(130/480),明显高于BKV的阳性率(13.33%,64/480,P<0.05),并且感染程度与免疫抑制剂FK506用量呈正相关。结论建立的同时检测BKV和CMV两种病毒载量的FQ-PCR方法具有快速、重复性好、灵敏的优点,可为临床监测肾移植术后病毒感染提供技术平台。
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