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目的构建柯萨奇B组病毒(CVB)载量绝对值定量实时荧光PCR检测标准品及建立标准曲线。方法 (1)在vero细胞上感染CVB3;(2)在柯萨奇B3病毒衣壳蛋白VP1基因保守区序列中设计合成特异性引物,PCR扩增后获得特异性产物;(3)PCR产物链接T载体,构建CVB3 VP1重组质粒;(4)对获得的CVB3 VP1充足质粒进行酶切分析及测序鉴定;(5)以CVB3 VP1重组质粒建立RT PCR标准曲线,建立柯萨奇B组病毒拷贝数绝对值定量RT PCR检测法,并进行稳定性和重复性实验。结果 (1)复制CVB3病毒株,感染vero细胞,克隆得到CVB3 VP1基因片段;(2)将CVB3 VP1基因片段链接载体构建得到重组质粒;(3)构建的重组质粒经酶切、测序,重组质粒cDNA序列和GenBank中提供的CVB3序列(模板)比对有99%的同源性且与引物设计的起始位点及终止位点一致;(4)构建的重组质粒作为标准品制备标准曲线具有较高的扩增效率和良好的线性关系(斜率为-3.32,R 2=0.99);熔解曲线分析提示,83℃的PCR产物是CVB3 VP1基因序列特异性产物,该标准品具有柯萨奇B组病毒特异性;(5)以CVB3 VP1重组质粒为标准品建立了RT PCR标准曲线,该标准品具有较大的检测范围(6.6×101～6.6×1010拷贝/μL),每个稀释梯度PCR可检测到50个拷贝的重组质粒,具有较高的灵敏度;(6)3次独立实验的变异系数CV<1.5%。,提示CVB3 VP1重组质粒标准品具有较高的稳定性和重复性。结论构建的CVB3 VP1重组质粒可以用做荧光定量PCR检测样品中柯萨奇B组病毒拷贝数绝对值定量标准品。