研究背景进针深度是针灸治疗的重要组成部分并直接影响针刺治疗的效果,为历代针灸医家所重视。虽然早期的研究结果已经从不同侧面显示了穴位深、浅刺的一些作用特点,但是目前对深、浅刺作用的评价多是基于临床疗效的观察而缺少系统的基础性实验研究。研究目的本研究从慢性炎性痛模型大鼠入手,以后三里穴为切入点,综合运用神经示踪、行为学、形态学和分子生物学等技术深入研究后三里穴区局部组织中神经纤维和免疫细胞的分布,与后三里穴深、浅刺相关的皮肤和肌肉组织的神经支配及神经化学成分的差异性,并在此基础上研究该穴深、浅电针对慢性炎性痛模型大鼠抗炎镇痛作用的差异,以及深、浅刺后穴位局部、脊神经节(dorsal root gangl ia,DRG)和脊髓中相关神经纤维、神经元和免疫细胞及其化学表达的变化,从神经通路、细胞间信号通路以及神经和免疫系统交互作用的角度阐明穴位深、浅刺对慢性炎性痛模型大鼠发挥抗炎镇痛作用的机制。研究方法1大鼠后三里穴区局部组织中神经纤维和免疫细胞的分布实验用正常清洁级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠3只,经心脏灌流后,切取后三里穴区局部组织,脱水后进行冰冻切片,然后进行免疫荧光组织化学检测,观察神经纤维、肥大细胞、巨噬细胞、树突状细胞和5-羟色胺(5-heyroxytryptamine,5-HT)阳性细胞在穴区局部组织中的分布,以确定后三里穴区不同层次组织中神经纤维和免疫细胞分布的差异。2后三里穴区深、浅层局部组织神经支配特征及其化学表达用神经示踪技术结合免疫荧光组织化学方法检测后三里穴深、浅层局部组织神经支配特征及其化学表达的差异,具体实验方法如下:实验用清洁级雄性SD大鼠14只,分别采用直刺和平刺法用微量注射器将4μL霍乱毒素亚单位B(cholera toxin subunit B,CTB)分别注入大鼠后三里穴的皮肤和肌肉组织中,注射后微量注射器留置1 min,然后缓慢出针以防止药液渗漏。示踪剂注入3d后,将大鼠进行灌流、取材、切片,免疫荧光组织化学方法染色,观察与不同层次组织相关的感觉和运动神经元的数量和节段性分布规律,以判断后三里穴区深、浅层局部组织神经支配是否存在差异。在此基础上,利用以上实验得到的组织切片进行多重免疫荧光组织化学染色,对与后三里穴区局部皮肤和肌肉组织相关感觉神经元的化学表达进行标记,以判断后三里穴区深、浅层局部组织神经支配的化学特征是否存在差异。检测的主要生物化学指标有P物质(substanceP,SP)和降钙素基因相关肽(calcitoningene-related peptide,CGRP)等,要求标记CTB的抗体和标记SP和CGRP的抗体来自不同种属的动物。3后三里穴深、浅刺对慢性炎性痛模型大鼠痛阈和炎症局部组织中免疫细胞的影响实验用清洁级雄性SD大鼠64只,随机分为对照组、模型组、深刺组和浅刺组。对照组:在异氟烷吸入麻醉下,对大鼠左侧后肢足底进行消毒,然后用微量注射器将50 μL 0.9%的氯化钠溶液注入足底皮下。模型组:麻醉和消毒方法同上,将50 μL完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)注入左侧后肢足底皮下制备慢性炎性痛模型。以痛阈降低30%作为造模成功的判定标准。深刺组:在炎性痛模型大鼠左侧后肢后三里穴用直刺的方法垂直进针,深达肌肉组织,深度约7 mm。连接韩式电针仪,刺激参数为2/100 Hz,1-2-3 mA,每个强度10 min,共30 min。浅刺组:在炎性痛模型大鼠左侧后肢后三里穴用平刺的方法以15°角进针,到达皮下组织。刺激参数同上。各组大鼠分别在造模前、造模后48 h及深、浅针刺后30 min三个时间点进行机械痛阈和热痛阈的测定。并于造模后48h且测定痛阈后,分别采用直刺和平刺法对模型大鼠左侧后三里穴的肌肉和皮肤进行针刺,以确定深、浅刺对慢性炎性痛模型大鼠机械痛阈和热痛阈影响的差异。电针结束30 min且测定痛阈后,每组其中8只大鼠经心脏灌流,切取炎症局部组织,脱水后进行冰冻切片,然后进行免疫荧光标记,检测炎症局部组织中肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、朗格汉斯细胞以及CGRP和SP阳性神经纤维的变化;每组中另外8只动物取新鲜的炎症局部组织,用免疫印迹法(westernblotting,WB)检测各组大鼠炎症局部组织中类胰蛋白酶含量的变化,以确定深、浅刺后炎症局部组织中免疫细胞和致痛物质的变化。4深、浅刺对后三里穴区局部组织中神经纤维和免疫细胞的影响在第三部分工作证明后三里穴深、浅刺对慢性炎性痛模型大鼠镇痛作用存在差异的基础上,观察穴区局部组织中神经纤维和免疫细胞在深、浅刺后的变化,来分析穴区不同层次组织中的神经纤维和免疫细胞是否参与介导了深、浅刺的不同作用。这部分的实验分组、痛阈测定和电针干预与实验3相同。每组16只大鼠。电针结束后30 min测定痛阈,随后将每组其中8只大鼠经心脏灌流,取下穴位局部组织,脱水后进行冰冻切片,然后进行免疫荧光标记,主要用于标记CGRP和SP阳性神经纤维以及肥大细胞、树突状细胞、5-HT阳性细胞和巨噬细胞,上述检测采用双标或多重免疫荧光组织化学染色在相邻的组织切片上完成;每组中另外8只动物取新鲜的穴位局部组织,用WB方法检测各组大鼠穴位局部组织中类胰蛋白酶含量的变化。5后三里穴深、浅刺对相关节段DRG和脊髓中神经元和胶质细胞及其化学表达的影响这部分的实验分组、痛阈测定和电针干预与实验3相同。每组16只大鼠。电针30 min结束后测定痛阈,每组其中8只动物经心脏灌流,取下L3-L5 DRG和腰段脊髓,脱水后进行冰冻切片,然后进行免疫荧光标记,检测的主要指标有SP、CGRP、辣椒素受体1(vanilloid receptor 1,VR1)、谷氨酸脱竣酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)、Ibal、小清蛋白(parvalbumin,PV)、维生素D依赖性钙结合蛋白(calbindin-D28k,CB)、神经元型钙结合蛋白1(neuronal calcium-binding proteins,NECAB1)、NECAB2 和神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitricoxidesynthase,nNOS)等;每组中另外8只大鼠取新鲜的L1-L6DRG和腰段脊髓,用WB和ELISA方法检测各组大鼠DRG和脊髗中PV、CB、NECAB1、NECAB2和SP的含量变化,以探讨DRG和脊髓中哪些改变参与介导了深、浅刺的作用机制。研究结果1后三里穴区局部组织中神经纤维和免疫细胞的分布后三里穴区皮肤中存在大量的神经纤维,它们在接近表皮时形成游离的神经末梢,可以作为神经感受器感受和传递针刺的机械刺激,部分纤维表现为CGRP、SP和酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)阳性。在肌肉里神经以神经束的形式存在,分支后一部分表现为特异性感觉神经纤维缠绕在梭内肌纤维表面形成螺旋状末梢,传导肌肉牵张感觉;另一部分形成的花枝状末梢主要传导本体感觉。另外,运动神经纤维在神经肌肉接头处形成花环样结构,该神经纤维呈现CGRP阳性表达,源于脊髓前角中的运动神经元。CGRP和SP阳性神经纤维在后三里穴区的皮肤和肌肉中都有分布,但在皮肤浅层分布的更密集。穴位中的免疫细胞,包括肥大细胞、树突状细胞、巨噬细胞,主要分布在真皮和皮下组织中,同时CGRP阳性神经纤维周围分布有大量的5-HT阳性细胞。2后三里穴深、浅层局部组织神经支配特征及其化学表达的差异将神经示踪剂CTB分别注射到后三里穴区皮下和肌肉组织后,标记的神经元和神经纤维终末均位于示踪剂注入侧的相关DRG、脊髓和薄束核中。与后三里穴浅层和深层组织相关联的感觉神经元分布在L1-L5DRG,集中分布在L4DRG中,与浅层组织相关感觉神经元的数量是支配深层组织感觉神经元数量的1.9倍。感觉神经元按直径大小可分为大(>50μm)、中(30-50μm之间)、小(<30μm)三类,与浅层组织相关的大、中、小感觉神经元的比例分别为10.4%、34.4%、55.2%,而与深层组织相关联的大、中、小感觉神经元的比例分别为14.5%、37.0%、48.5%,可见与浅层组织相关联的小型感觉神经元的比例更高。与后三里穴区浅层和深层组织相关联的部分感觉神经元同时呈现CGRP或SP阳性表达。其中,与浅层组织相关联的感觉神经元有28.7%呈CGRP阳性表达,38.4%呈SP阳性表达;而与深层组织相关联的感觉神经元有39.2%呈CGRP阳性表达,19.4%呈SP阳性表达。3后三里穴深、浅刺对慢性炎性痛模型大鼠痛阈和炎症局部组织中免疫细胞的影响在痛阈方面,造模前各组大鼠的机械痛阈没有差别,造模后48 h造模各组大鼠的机械痛阈与对照组比较均显著降低(P<0.00l);分别给予后三里穴深、浅电针后,深刺组和浅刺组的机械痛阈与模型组比较均显著提高(P<0.001,P<0.01),其中深刺组提高的更为明显,浅刺组的机械痛阈仍低于对照组(P<0.01)。深刺组针刺后与造模后比较,机械痛阈提高百分率为71.7%;浅刺组针刺后与造模后比较,机械痛阈提高百分率为51.6%。各组大鼠的热痛阈在造模前没有差别,造模后48 h造模各组大鼠的热痛阈与对照组比较均显著降低(P<0.001);分别给予后三里穴深、浅电针后,深刺组和浅刺组的热痛阈与模型组比较均显著提高(P<0.05,P<0.001),其中浅刺组提高的更为明显,深刺组的热痛阈仍低于对照组(P<0.05)。深刺组针刺后与造模后比较,热痛阈提高百分率为33%;浅刺组针刺后与造模后比较,热痛阈提高百分率为65.3%。在炎症局部组织中的免疫细胞方面,造模后,炎症局部组织中大量肥大细胞被激活,引起脱颗粒反应;血管周围出现了大量的巨噬细胞和中性粒细胞;5-HT阳性细胞数量增加;表皮中朗格汉斯细胞的数量减少;炎症局部组织中CGRP和SP阳性神经纤维的数量增加。给予后三里穴位深、浅电针后,激活的肥大细胞、巨噬细胞和中性粒细胞数量减少;明显减少了炎症局部组织中5-HT的合成和释放,与模型组相比5-HT阳性细胞数量减少(P<0.05):朗格汉斯细胞数量增加;CGRP和SP阳性神经纤维的数量减少。WB结果显示与对照组相比,模型组炎症局部组织中类胰蛋白酶的含量增加(P<0.001);与模型组相比,深刺组蛋白含量减少(P<0.01),浅刺组未见减少(P>0.05)。4深、浅刺对后三里穴区局部组织中免疫细胞的影响造模后,后三里穴区局部组织中肥大细胞被激活,给予后三里穴位深、浅电针后,激活的肥大细胞数量未见减少,同时,大部分肥大细胞仍保持脱颗粒状态。WB结果显示与对照组相比,仅深刺组穴位局部组织中类胰蛋白酶的含量增加(P<0.05);模型组和浅刺组未见明显增加(P>0.05)。造模后,后三里穴区局部组织中树突状细胞和5-HT阳性细胞的数量未见明显改变,巨噬细胞的数量稍有增加,给予后三里穴位深、浅电针后,树突状细胞、5-HT阳性细胞和巨噬细胞的数量明显增加。5后三里穴深、浅刺对相关节段DRG中感觉神经元及其化学物质表达的影响造模后,DRG中CGRP、SP、VR1和nNOS阳性感觉神经元的数量增加,给予后三里穴深、浅电针后阳性神经元数量减少。VR1表达在小直径的神经元上,少量与CGRP共表达。SP大部分与CGRP共表达。ELISA结果显示造模后,DRG中SP蛋白含量有增加的趋势,给予深、浅针刺后蛋白含量有减少的趋势,但各组差异无统计学意义。造模后,DRG中PV和CB阳性神经元的数量减少,给予后三里穴位深、浅电针后阳性神经元数量增加。PV表达在中等和大直径神经元上,CB主要表达在中等和小型神经元上,部分神经元二者共表达。WB结果显示与对照组相比,模型组DRG中PV和CB蛋白含量减少(P<0.05);与模型组相比,深刺组和浅刺组PV和CB蛋白含量均增加(P<0.05),但深刺组CB蛋白含量仍低于对照组(P<0.05)。6后三里穴深、浅刺对相关节段脊髓中神经纤维、神经元和胶质细胞及其化学物质表达的影响CGRP和SP阳性神经纤维投射到脊髓背角浅层,造模后CGRP和SP阳性纤维投射明显增加,与对照组相比CGRP受体阳性神经元数量增加(P<0.001),SP受体阳性神经元出现受体内摄现象。给予后三里穴位深、浅电针后,CGRP阳性纤维终末的密度明显减少,其受体的数量亦减少(P<0.001,P<0.01),SP受体的内摄减少,其中深刺组减少的更为明显。给予后三里穴位深部电针后,SP阳性纤维密度减少,给予皮下电针后纤维终末密度未见改变。ELISA结果显示与对照组相比,模型组SP蛋白含量增加(P<0.05);与模型组相比,深刺组蛋白含量减少(P<0.05),浅刺组未见明显改变(P>0.05);浅刺组SP蛋白含量高于深刺组(P<0.05)。造模后VR1阳性纤维终末密度增加,给予后三里穴位深、浅电针后,其纤维密度减少,其中浅刺组减少的更为明显。与对照组相比,其他三组脊髓背角浅层的GAD密度均增加,深刺组增加的更为明显。造模后,脊髓背角的小胶质细胞发生活化,nNOS阳性神经元数量增加(P<0.01),深刺和浅刺后明显抑制了小胶质细胞的活化状态,深刺组小胶质细胞活化状态抑制的更明显。同时,nNOS阳性神经元的数量减少(P<0.01,P<0.05)。造模后,脊髓背角胶状质中PV阳性神经纤维的密度下降,背角浅层中CB免疫阳性神经元的数量也减少。给予深、浅电针后均明显提高了PV 阳性神经纤维的密度,给予深部电针增加了 CB免疫阳性神经元的数量。WB结果显示与对照组相比,模型组脊髓背角中PV蛋白含量减少(P<0.05);与模型组相比,深刺组和浅刺组PV蛋白含量均增加(P<0.05)。与模型组相比,仅深刺组提高了CB蛋白含量(P<0.05)。造模后,NECAB1和NECAB2阳性神经元数量增加,给予深刺和浅刺后,NECAB1和NECAB2阳性神经元的数量减少,深刺组减少的更明显。WB结果显示与对照组相比,模型组脊髓背角中NECAB1和NECAB2蛋白含量增加(P<0.05);与模型组相比,深刺组蛋白含量减少(P<0.05),浅刺组未见减少(P>0.05)。结论1行为学结果显示后三里穴深、浅刺激均提高了慢性炎性痛模型大鼠的机械痛阈和热痛阈,但是提高程度存在差异。与浅刺相比,深刺组更明显的提高机械痛阈,而浅刺对热痛阈的提高更显著。2神经示踪结果显示的后三里穴深、浅层相关局部组织神经支配及其化学特征的差异性可能是深、浅针刺发挥不同效应的神经解剖学基础。3后三里穴位深刺和浅刺后穴位局部大量增加的免疫细胞可能参与针刺信号的感受和放大,因此其可能是深、浅刺发挥效应的始动因素。而深、浅针刺通过调节炎症局部的免疫细胞的数量和活性,产生抗炎镇痛作用。4 DRG中伤害性感觉神经元受体数量的减少和缓冲型钙结合蛋白含量的增加,可以阻断伤害感受冲动从伤害性感觉神经元传至脊髓背角,从而起到镇痛作用,其可能是浅刺后三里穴位发挥镇痛作用的主要机制。5脊髓背角中神经递质释放的减少、CGRP受体数量的减少,小胶质细胞的活化状态的抑制,缓冲型钙结合蛋白含量的增加、NECAB1/2含量的减少,共同介导了深刺的镇痛作用,这可能是深刺后三里穴位发挥镇痛作用的主要机制。综上所述,穴位和炎症局部的外周免疫细胞、神经环路中位于DRG和脊髓背角的一级和二级神经元神经递质的释放、受体数量的改变、小胶质细胞的状态和细胞内钙结合蛋白的变化可能介导了深刺和浅刺的起始效应和对慢性炎性痛模型大鼠镇痛作用的差异。