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中国南方鼻咽癌患者绝大多数EB病毒阳性,鼻咽癌细胞表达相关EB病毒的抗原,包括EBNA1,LMP1(40-60%),LMP2和BARF0,在鼻咽癌组织发现大量浸润淋巴细胞。因而,采用自体EBV-特异性CTL转移继发免疫治疗鼻咽癌是当前鼻咽癌治疗的研究热点。但是,关于鼻咽癌患者在治疗前外周血循环系统及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞免疫反应状态及其对EBV特异性CTL细胞转移继发免疫治疗的影响目前尚不清楚,因而本研究分析了关于鼻咽癌患者PBMC和TIL的细胞免疫反应状态,体外建立鼻咽癌患者EBV-特异性CTL并进行免疫表型分析及免疫功能检测并对分析了鼻咽癌患者TIL细胞体外的免疫功能。方法:经患者同意,收集鼻咽癌患者外周血标本5例,外周血与鼻咽癌组织配套标本3例。外周血分离PBMC细胞,体外建立EB病毒转化LCL细胞系,及经γ射线照射后自体LCL细胞刺激PBMC细胞(效应细胞:靶细胞40:1)建立EBV-特异性CTL,7天后用含人重组hRIL-2(20IU/mL)或hRIL-2(20IU/mL)加hRIL-7(10ng/mL)的1640培养液中培养(5-10%人AB血清)、扩增;鼻咽癌组织消化后分离鼻咽癌细胞进行原代培养,在含hRIL-2的1640培养液(5-10%人AB血清)内维持及扩增TIL淋巴细胞;流式检测用不同荧光标记的人CD3、CD4、CD8、CD16及CD45RA、CD45RO及CXCR3/CXCR4抗体染色鼻咽癌患者PBMC、TIL及CTL细胞的免疫表型,细胞亚群及分化状态;细胞胞内染色流式分析IFNγ的分泌水平检测CTL的免疫功能;51Cr释放实验检测CTL细胞及TIL细胞的细胞毒性作用;免疫组化分析鼻咽癌患者鼻咽癌组织EB病毒LMP1的表达和原位杂交分析EB病毒EBER1mRNA的表达,以确定患者鼻咽癌细胞的EB病毒阳性。结果:1、5例鼻咽癌患者体外成功建立EBV-特异性CTL细胞系,细胞数目达到治疗水平(>108)。2、用含hRIL-2+hRIL-7培液培养的EBV-特异性CTL比单纯含hRIL-2培液培养的EBV-特异性CTL细胞数目扩增快(约2-3倍),但其免疫表型及细胞毒性作用无显著性差异。3、分析比较鼻咽癌患者外周血PBMC,TIL细胞及CTL细胞的免疫表型:在5例鼻咽癌患者中有3例PBMC细胞的CD3+细胞数目低于正常范围(54.8-83.0%),2例CD3+CD8+,CD3+CD4+Tc和Th淋巴细胞数目低于正常范围(17.9-47.5%;23.1-51.0%),CD3-CD16+NK细胞数目高于正常范围(7.1-38.0%);5例鼻咽癌患者其中3例CTL细胞的CD3+细胞数目>80%(83-94%),CD3+CD8+(60-72%),CD3+CD4+(11-33%),CD3-CD16+NK细胞(2-10%),在PBMC免疫细胞表型CD3+、CD3+CD8+,CD3+CD4+低于正常范围,CD3-CD16+NK细胞数目高于正常范围的两例鼻咽癌患者CTL细胞CD3+(40%,62%),CD3+CD8+(41.1%,60%),CD3+CD4+(11%,6.4%),CD3-CD16+NK细胞(45.7%,27%);在对2例鼻咽癌患者TIL细胞免疫表型进行分析,其中1例PBMC细胞各免疫细胞亚群均在正常范围,TIL细胞CD3+(93%),CD3+CD8+(44.5%),CD3+CD4+(59.5%),CD3-CD16+NK细胞(4.0%),另一例PBMC免疫细胞表型CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+低于正常范围的鼻咽癌患者,其TIL细胞CD3+(40%),CD3+CD8+(10.5%),CD3+CD4+(28.5%),CD3-CD16+NK细胞(34%)。4、鼻咽癌患者EBV-特异性CTL细胞体外51Cr释放细胞毒性实验检测:EBV-特异性CTL细胞体外杀伤自体LCL细胞为(35-50%),自体NPC细胞为(25-50%),其中PBMC免疫表型正常的鼻咽癌患者CTL细胞对错配LCL细胞或EBV阳性的鼻咽癌细胞系C666的杀伤为(4-9%),但PBMC免疫表型异常的鼻咽癌患者CTL细胞对错配LCL细胞或EBV阳性的鼻咽癌细胞系C666的杀伤为(20-50%),所有鼻咽癌患者EBV-特异性CTL细胞对自体PHA母细胞的杀伤为(0.5-8%),以上结果的效应细胞:靶细胞=10:1;流式检测EBV-特异性CTL细胞在体外经自体LCL或PHA母细胞刺激后IFNγ分泌的CD3+阳性细胞数分别是(3.8-11%,0.5-2.6%)5、两例鼻咽癌患者TIL细胞在体外对自体LCL或NPC的杀伤为(5%,20%),错配LCL或EBV阳性的鼻咽癌细胞系C666的杀伤为(11%,18%)。5、5例鼻咽癌患者鼻咽癌组织均为EB病毒阳性。结论:鼻咽癌患者EBV-特异性CTL细胞在体外能成功扩增,并且细胞数目可达到回输治疗水平;EBV-特异性CTL细胞在体外对自体的LCL及NPC细胞有特异性杀伤作用,而对HLA错配的LCL及鼻咽癌杀伤作用低,对自体的非抗原靶细胞无杀伤作用;部分鼻咽癌患者PBMC存在CD3+T淋巴细胞及CD3+CD8+细胞毒性T淋巴细胞及CD3+CD4+辅助T淋巴细胞抑制,CD3-CD16+NK细胞数目增高现象,在PBMC免疫抑制的鼻咽癌患者体外扩增的CTL细胞中NK细胞数目较多,其毒性杀伤作用非特异性较大,可能会影响其免疫治疗作用。鼻咽癌患者TIL细胞多数为CD3+的T淋巴细胞,但存在免疫功能抑制,对自体的LCL或鼻咽癌细胞杀伤作用低,其杀伤作用为非特异性。