背景与目的:非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是不孕不育的疑难重症,约占男性不育症的10%-15%。睾丸显微取精术(microdissection testicular sperm retrieval,micro-TESE)是治疗NOA患者的重要临床手段,借助光学显微镜可使40%-60%的患者获得精子。然而,睾丸显微取精术对于生精小管的选择依赖于对颜色和体积的主观判断,不足以评估管腔内是否存在精子。且睾丸生精小管的过多取材将会增加术后风险,如睾丸血供损伤、血清睾酮水平下降等。拉曼光谱(Raman spectroscopy)扫描是一种无标记激光检测技术,它可以提供物质化学组成和分子结构的相关信息,并反映在二维的拉曼光谱谱峰上。由于无创性和实时检测等优势,拉曼光谱技术已被广泛用于临床研究,特别是肿瘤组织的鉴别鉴定。本研究应用拉曼光谱分别扫描小鼠和人睾丸生精小管,评估有无精子发生,探索拉曼光谱用于评估生精小管生精功能的可行性,旨在为提高无精子症患者精子获取率,建立新的取精方法提供理论依据和实验基础。第一部分拉曼光谱扫描:无创评估小鼠生精小管精子发生状况目的:探索拉曼光谱用于鉴别正常小鼠和唯支持细胞综合症(Sertoli cell only syndrom,SCO)小鼠睾丸生精小管的可行性。方法:14只成年雄性ICR小鼠分为实验组(SCO组)和对照组(正常生精组)。SCO组以5mg/ml按照白消安40mg/Kg小鼠体重,进行腹腔单次注射,正常生精组以同样方式和剂量予生理盐水注射。4周后称量小鼠睾丸重量,一侧睾丸行生精小管拉曼光谱检测,另一侧睾丸行组织病理学分析及Johnsen Score评分。结果:(1)SCO组小鼠单个睾丸重量为(40.43±9.05)mg;正常生精组小鼠睾丸重量为(136.50±13.44)mg。(2)SCO组小鼠睾丸生精小管Johnsen评分为2.86±0.74;正常生精组小鼠睾丸生精小管Johnsen评分为8.28±0.57。(3)sCO组小鼠睾丸生精小管拉曼光谱强度在1,001 cm-1,1,096cm-1,1,124 cm-1处明显高于正常生精组小鼠。使用判别分析,拉曼光谱鉴别正常生精小管和SCO小管的敏感度和特异度分别为88.24%、90.91%。结论:拉曼光谱扫描可以鉴别正常小鼠和SCO小鼠睾丸生精小管,评估其生精功能。本研究为应用拉曼光谱评估人睾丸生精小管的生精功能,提供实验基础。第二部分拉曼光谱无创评估男性不育症者生精小管精子发生状况目的:探索拉曼光谱用于体外无创评估人睾丸生精小管生精功能的可行性。方法:本研究经仁济医院伦理委员会批准,并获得患者书面知情同意。2012年10月至2013年4月,收集仁济医院接受无精子症手术治疗患者的睾丸组织共52例,行拉曼光谱检测、组织病理学分析、界膜厚度测量、免疫组化分析(type-Ⅰ,Ⅲ,Ⅳcollagens and laminin)、以及气相色谱-质谱联用仪(Gas Chromatograph-Mass Spectrometercomputer,GC-MS)检测。结果:(1)52例睾丸组织根据病理类型分为正常生精组(10例)、生精阻滞组(MA组,24例)、SCO组(18例)。(2)OA患者生精小管拉曼光谱强度<2,000(au),NOA患者生精小管拉曼光谱强度>2,000(au),拉曼光谱强度与生精功能(Johnsen Score)呈显著负相关。使用K-means聚类算法进行分析,拉曼光谱预测睾丸生精功能敏感度和特异度分别为90.0%、85.71%。(3)NOA睾丸生精小管界膜厚度增厚,与生精功能呈显著负相关,且type-Ⅰ和type-Ⅲ胶原蛋白含量升高。(4)GC-MS检测出361种睾丸组织代谢物,其中12种在OA和NOA睾丸中有显著性差异。结论:精子发生障碍严重影响患者及其家庭的生活质量,探索无创评估无精子症患者睾丸生精状况,是男科研究的热点与挑战。本研究表明,生精小管拉曼光谱扫描可以体外无创评估人生精小管的生精功能,进一步的体内研究将有助于判断拉曼光谱是否可以用于辅助睾丸显微取精术,提高精子获取率。