拟穴青蟹(Scylla paramamosain)部分基因组富集文库构建及多态微卫星标记制备

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拟穴青蟹(Scylla paramamosain)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla),在我国主要分布于东南沿海各省,以福建、广东、海南最多,是我国重要的养殖蟹类之一。本文以拟穴青蟹为研究对象,构建了4个部分基因组富集文库,制备多态微卫星标记。首先,利用限制性内切酶MseⅠ酶切基因组DNA,连接上接头后,进行PCR富集;然后,分别与4种经生物素标记的探针(GA)13、(GT)13、(CAA)11、(GATA)8进行杂交;最后,与包被了链亲和素的磁珠结合,经四步洗脱后,获得含有单链目的片段的洗脱液。洗脱液再经过PCR富集后,连接到pMD19-T载体中,转化到DH5α感受态细胞中,涂于LB选择性平板,建立4个微卫星富集文库。每个富集文库大约有1800个左右的克隆,从每个文库中随机挑取500个克隆,经PCR检测后,选取插入片段在300~700之间的阳性克隆共计1100个进行测序。结果共获得了853条含有微卫星重复的单一序列,成功设计了603对拟穴青蟹微卫星引物。利用从福建宁德地区采集的一个拟穴青蟹群体(29尾个体)对其中的100对引物进行多态性检测,结果有28个位点表现出多态性。这28个微卫星位点共扩增到174个等位基因,每个位点的等位基因数(Na)、观测杂合度(HO)和期望杂合度(HE)分别处于2~12、0.38~1.00和0.41~0.91之间,平均值分别为6.2、0.76和0.72。有6个位点显著偏离了哈代-温伯格平衡,各位点之间不存在连锁不平衡现象。本文报道的拟穴青蟹微卫星标记将为其群体遗传结构和遗传多样性评估、遗传连锁图谱构建和数量性状位点(QTL)定位奠定基础。
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