论文部分内容阅读
目的硝酸盐、亚硝酸盐广泛存在于水体和食品当中,进入人体的硝酸盐通过血液循环先到达唾液腺再分泌至口腔,经细菌还原为亚硝酸盐后最终摄入体内。低浓度的毒物往往存在对生物体毒物兴奋效应,低水平的亚硝酸钠暴露对细胞生物学效应实验研究文献报道较少,本研究利用微囊化肝细胞,研究了亚硝酸盐从低浓度到高浓度时细胞增殖、凋亡等的影响。方法静电液滴法制备微胶囊,HepG2细胞用MEM培养液(含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 U/ml链霉素,1 mM丙酮酸钠)在5%CO2细胞培养箱中进行常规单层培养。待细胞长到对数生长期,用0.25%胰酶消化,生理盐水洗涤三次,离心收集细胞,计数,悬浮于1.5%(w/v)的海藻酸钠溶液中,利用微囊静电液滴发生器喷入0.1 mol/LCaCl2溶液中,形成海藻酸钙胶珠,然后用0.05%(w/v)多聚赖氨酸包裹,再与0.15%(w/v)的海藻酸钠溶液反应,最后用55 mM柠檬酸钠溶液处理,获得微囊化的肝细胞。将制备好的微囊化肝细胞于37℃,5%CO2培养箱中培养,所用培养液与贴壁细胞相同。取0.2 mL的APA微囊化HepG2细胞,接种于24孔板中,分别用含有不同浓度亚硝酸钠的DMEM培养液处理微囊化细胞(每个浓度5个复孔),培养第12,24,36和48h,用CCK-8试剂测定细胞活性并在相差显微镜下观察细胞状态,拍照。用RT-PCRDHPLC检测基因Bax,Bak,Bcl-2,Casp3 mRNA表达。结果亚硝酸钠对APA-HepG2增殖的毒物兴奋效应:剂量-增殖效应关系呈倒U型曲线,表现为低剂量促进,高剂量抑制。最大毒物的兴奋作用出现在第48h,最大毒物兴奋剂量为1.6mg/mL,亚硝酸钠浓度低于3.2mg/mL时呈非线性刺激细胞增殖,最大毒物兴奋效应为对照组的139%。低剂量亚硝酸钠诱导c-myc mRNA表达增加,而c-myc能促进糖酵解通路上许多酶活性增加,促进细胞葡萄糖转运,增加糖酵解,促进细胞增殖。结论本研究利用生物微胶囊技术体外进行肝细胞的三维培养,构建一种新的毒性效应评价模型。