大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产的毁灭性病害之一。大豆疫霉全基因组和大量的EST数据已公布,为开展该病原菌的功能基因组研究提供了便利,但是由于疫霉基因组大且结构复杂,疫霉遗传转化体系建立困难重重,疫霉功能基因组研究进展十分缓慢。本研究组通过多年的探索,建立了大豆疫霉菌的稳定和瞬时基因沉默体系,建立了基于新一代RNA测序技术的高通量基因表达分析平台(Solexa),并综合利用这些技术,就大豆疫霉对环境信号的感知、发育与致病过程的功能基因组开展了系统的研究。1、瞬时基因沉默体系的建立:本研究组在国际上首次运用dsRNA介导的瞬时基因沉默技术对大豆疫霉菌的目标基因进行沉默研究。选用了大豆疫霉的一个无毒基因Avr3a和细胞周期调控子CDC14作为研究对象,将外源合成的特定dsRNA转化到PEG/CaC12介导的原生质体中来诱导特定基因的沉默并建立了大豆疫霉的瞬时转化体系。dsRNA介导的瞬时转化所得到的转化子在第8天开始诱导特异基因的沉默,12天左右沉默效率最高,第17天开始恢复,沉默效率在50%以上的转化子约占75%以上,基因沉默效率最高可以达到95%以上。表型分析证明Avr3a沉默的转化子接种含有对应Rps3a的植株,其致病力明显强于受体菌株;CDC14的沉化子不能形成游动孢子囊。分析证明Avr3a沉默的转化子中CDC14表达没有显默转著变化,表明dsRNA介导的基因沉默具有序列特异性。本研究表明dsRNA介导的大豆疫霉瞬时基因沉默系统可以用来分析基因的功能,为大豆疫霉功能基因组研究提供了重要工具。2、大豆疫霉趋化性的分子机制:根据基因组、EST数据,Solexa以及Real-time PCR数据对编码大豆疫霉G蛋白和GPCR的基因进行分析,结果显示G蛋白α亚基PsGPA1和GPCR蛋白PsGPR11在游动孢子相关阶段特异表达。我们利用稳定遗传转化系统获得PsGPA1和PsGPR11基因的沉默突变体。发现PsGPA1基因沉默突变体游动孢子对大豆根部分泌的异黄酮类物质的趋向性明显被削弱,游动孢子的游动速度和游动距离大大降低,游动时将明显缩短,休止胞的萌发能力明显下降。此外突变体游动孢子的致病性较野生型明显下降,这种表型是由于突变体游动孢子的趋化性、游动能力和休止胞萌发能力的下降导致的。而PsGPR11的沉默突变体则出现游动孢子释放率显著下降,50%的孢子囊未能完全释放出游动孢子,休止孢萌发能力明显下降,突变体的游动孢子丧失了对大豆的致病性。这是国际上首次报道大豆疫霉菌G蛋白信号途径参与该菌独特的发育和致病过程。3、大豆疫霉侵染过程的信号传导:对采用Solexa技术建立的大豆疫霉转录组数据并结合生物信息分析方法找到了一系列在大豆疫霉侵染寄主过程中特异表达的基因,其中包括一个在大豆疫霉游动孢子及休止孢阶段特异表达的促有丝分裂原活化的蛋白激酶编码基因PsSAK1和几个重要的转录因子等。PsSAK1与芽殖酵母的Hogl,稻瘟菌Osm1同归属于胁迫诱导的MAPK,但是PsSAK1拥有一个独特的PH结构域。Real-time PCR结果表明PsSAK1受逆境盐胁迫及氧化压力胁迫诱导上调表达。对两个PsSAK1沉默转化子的表性分析发现,PsSAK1的沉默并没有影响大豆疫霉的菌丝生长速率,菌丝,菌落及游动孢子囊形态,游动孢子和卵孢子产量,但突变体对高渗透的抗性显著下降,此外该基因的突变严重影响了游动孢子的发育及侵染寄主的能力,游动孢子休止显著提前,休止孢萌发率下降,侵染时芽管相对于野生型显著延长,顶端附着胞产量减少且几乎不能侵入寄主,导致大豆疫霉致病性丧失。这是首次报道MAPK参与调控大豆疫霉发育及致病过程。目前本研究组正以PsGPA1等几个突变体为材料,利用酵母双杂交技术、Solexa RNA测序技术和蛋白质二维电泳等技术、进一步研究G蛋白和MAPK信号途径在大豆疫霉菌发育和致病过程中的作用。这些研究将助于在分子和基因组水平上解释疫霉菌病害的发生机制,并针对性地开发疫霉菌病害的控制措施。