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研究目的1.建立人脐带干细胞体外分离、培养的方法,研究其生物学特性和表型特征,用于本实验下一步研究及进一步用于组织工程、细胞和分子生物学的研究。2.探讨人脐带间充质干细胞对化疗药物盐酸氮芥诱导的卵巢颗粒细胞凋亡的影响及可能机制。研究方法1.在无菌条件下取足月健康胎儿脐带标本,用双酶消化法、组织块贴壁法两种方法分离、纯化脐带间充质干细胞(UC一MSC),同时进行两种方法的对比。分离的原代干细胞用含10%的胎牛血清的DMEM培养基培养,消化传代后,取P4-P8代的细胞做共培养修复用。2.采自中山医科大学第一附属医院生殖中心接受体外受精—胚胎移植(IVF-ET)的患者共45例,年龄27～35岁,有排卵证据,基础状态生殖激素水平正常,均为输卵管因素或男方因素不孕者。采用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH2a)/基因重组人卵泡刺激素(rFSH)/人绝经期促性腺激素(HMG)/人绒毛膜促性腺激素(HCG)超促排卵方案,定期监测卵泡发育。当优势卵泡直径>17 mm时,肌内注射10 000 U HCG,于注射36 h后B超下经阴道穿刺卵泡采集卵母细胞,同时收集卵泡液。分离出其内的卵巢颗粒细胞,待其贴壁加入不同浓度的化疗药物盐酸氮芥(浓度分别为0.5mg/1、2.5mg/l、5mg/1)致培养基中作用24h后,检测凋亡后选择最佳浓度,一组为待其损伤后与脐带间充质干细胞以不同比例共培养48h,另一组为加入化疗药物损伤的同时与脐带问充质干细胞共培养,化疗药物同样作用24h,脐带间充质干细胞共培养72h,采用PI-Hoechst 33342双染,检测凋亡率,DNA-ladder检测凋亡片段产生,Western-blot检测颗粒细胞凋亡相关蛋白bcl-2和caspase-3表达的变化。评价UC一MSC在化疗所致卵巢颗粒细胞损伤中的修复作用。结果1.体外培养的脐带间充质干细胞形态均一,呈长梭行旋窝状生长,培养的第三代细胞97%以上表达CD44,CD29,CD59,CD105,但不表达造血及内皮细胞相关抗原CD28,CD31,CD34,CD45,亦不表达免疫排斥相关抗原CD40,CD86,HLA-DR,证实为间充质干细胞,脐带间充质于细胞大部分处于静止期和DNA合成前期(G0/G1期),只有少数处于分裂期和DNA合成期。2.盐酸氮芥浓度为5mg/l时,卵巢颗粒细胞的凋亡率增高,生长抑制程度明显,在DNA-ladder上也可见明显的断裂条带,因此选用该浓度来诱导颗粒细胞凋亡。UC-MSCs体外共培养修复化疗所致颗粒细胞损伤的效果不是十分理想,但在预防化疗所致颗粒细胞损伤的效果较对照组差异有统计学意义,即在加入凋亡诱导剂的同时与脐带间充质干细胞共培养,其凋亡率较实验对照组明显降低(共培养组早期凋亡率为22.43±0.45%,晚期凋亡率为13.57±1.58%,实验对照组早期凋亡率为25.23±1.07%,晚期凋亡率为29.57±2.74%)。差异有统计学意义(P值均为0.000).Western-blot结果显示,共培养组颗粒细胞bcl-2表达水平较阴性对照组增高,而procaspase-3表达则下调。结论人UC一MSC可以有效预防化疗所致卵巢颗粒细胞损伤,且能够上调bcl-2的表达和下调procaspase-3的表达从而抑制颗粒细胞的凋亡。