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目的前期实验我们发现人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)基因在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中低表达,为探索PTEN基因低表达的具体机制,本研究探讨了CLL患者中PTEN突变、PTEN基因启动子和mi RNA是否影响其表达。方法收集154例初诊CLL患者和200例配对的健康正常人标本,采用聚合酶链式反应(PCR)联合DNA测序检测PTEN基因第5~9外显子的基因序列,并分析PTEN基因突变与患者临床预后指标的关系。采用巢式甲基化特异性聚合酶链式反应(n MSP)检测75例初诊CLL患者和25例正常对照者PTEN基因甲基化状态,阳性结果经基因测序验证。通过生物信息学方法候选出调控PTEN基因的保守mi RNA并用双荧光素酶报告基因验证,筛选靶向作用PTEN的反义mi RNA转染CLL原代细胞培养24小时,采用蛋白免疫印迹杂交(WB)和PCR检测转染PTEN基因和mi RNA的前后变化,流式细胞术(FCM)Annexin/PI双染法检测转染前后的细胞凋亡率。结果 1154例CLL患者和200例正常对照人群均未发现PTEN基因第5~9外显子的突变,CLL患者和正常人在第8内含子intron 8 c.1026+32存在一处单核苷酸多态性(SNP)位点,编号为rs555895。CLL患者该位点的T/T、T/G和G/G基因型频率分别为24.0%、52.6%和23.4%,与正常对照人群对应的17.0%、58.5%和24.5%的基因型相比,并未有统计学意义(P=0.255)。CLL患者的T/T纯合子基因型与(T/G+G/G)基因型频率分别为24.0%和76.0%,与正常对照人群相比,在统计学上也未出现显著性差异(P=0.102),此位点的T/T纯合子基因型与(T/G+G/G)基因型频率与CLL患者的一般生物学特征也未表现显著差异。275例CLL患者仅发现一例存在PTEN基因的部分甲基化(1.33%),正常对照标本均未出现甲基化,而阳性对照出现明显的甲基化条带。甲基化状态经测序后验证,测序图中显示甲基化患者的C序列未发生改变,而无甲基化者碱基C变成T。此例患者临床特征表现为高白细胞,ZAP-70阳性和共济失调性毛细血管扩张突变(ATM)基因缺失。3双荧光素酶报告实验显示mi R-21 minic、mi R-26a minic和mi R-214 minic均对PTEN基因有显著抑制作用。检测转染反义mi R-21、反义mi R-26a和反义mi R-214的mi RNA水平,相应的mi RNA明显受抑制(P=0.014、P=0.040和P=0.001)。FCM检测到转染反义mi R-26a和反义mi R-214组的细胞凋亡率要明显高于转染NC组(P<0.001和P=0.001),通过WB和PCR证实转染反义mi R-26a和反义mi R-214组的PTEN的蛋白和m RNA水平均较NC组上调。结论 CLL细胞中PTEN的低表达可能与mi RNA的异常表达相关,如mi R-26a和mi R-214的过表达,而与此基因的突变和启动子甲基化可能无关。抑制PTEN基因的靶向mi RNA可促进细胞的凋亡,为CLL的治疗和新药的研发提供新的靶点和理论依据。