【摘 要】
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目的构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)C蛋白编码基因重组子并鉴定。方法以JEV SA14-14-2株Total RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增JEV C蛋白编码基因,基因两侧加入起始密码子以及终
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目的构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)C蛋白编码基因重组子并鉴定。方法以JEV SA14-14-2株Total RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增JEV C蛋白编码基因,基因两侧加入起始密码子以及终止密码子。切胶回收PCR产物并经"A"处理,将PCR产物与pMD19-T simple连接构建重组子pMD-JC并测序。为便于分析JEV C蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV C蛋白编码基因5’端附加FLAG序列,并亚克隆至pcDNA3.1(+)载体中,构建重组子pJC并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJC转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。免疫荧光检测转染的CHO细胞中JEV C蛋白分布与表达。结果以流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株Total RNA为模板,RT-PCR法获得含有FLAG片段的JEV C蛋白编码基因重组子,测序分析与发表的基因序列相符合。经酶切鉴定表明:重组质粒pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子在500bp左右,与JEVC蛋白编码基因和FLAG基因序列之和(414bp)相一致。应用pcDNA3.1 T7噬菌体启动子引物测序分析目的基因在真核表达载体中正常连接。JEV C蛋白编码基因重组质粒转染的CHO细胞可见较显著绿色荧光标记,主要分布胞浆,胞膜。单纯载体转染或未进行转染的CHO细胞中未见特异性绿色荧光标记,仅见散在的无特异性绿色荧光杂质。结论 pJC成功构建,转染的CHO细胞可表达JEV C蛋白。
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