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利用黄瓜单克隆抗体芯片分析筛选疫霉菌侵染前后黄瓜子叶中差异表达蛋白,发现CsCAT1对疫霉菌侵染具有强烈响应。在黄瓜子叶中瞬时过表达Cs CAT1导致子叶疫霉菌抗性减弱,而利用RNAi干扰子叶中CsCAT1则导致抗性增强。因此,Cs CAT1可能直接参与调节黄瓜疫病抗性响应,具有潜在的应用价值。1、芯片分析材料的制备:将1周龄黄瓜子叶剪下后置于直径10 cm培养皿中,皿内事先放置滤纸并加入5m L无菌水。取在V8培养基上生长5d的疫霉菌菌块置于子叶表面,以放置了空白V8培养基琼脂块的子叶为负对照。按时间梯度取5次样,分别提取总蛋白,孵育抗体芯片并利用PowerScannerTM生物芯片扫描仪进行分析。2、瞬时过表达和沉默CsCAT1:CsCAT1全长CDS克隆到pGWB5载体用于过表达;CsCAT1特异外显子序列约280bp克隆到pK7GWIW(II)载体用于RNAi干扰。载体分别转化农杆菌GV3101菌株后注射转化黄瓜子叶。提取转化后子叶总RNA并利用qRT-PCR验证转化的有效性。3、瞬时转化材料的抗性分析:取瞬时转化黄瓜子叶置于培养皿中,皿内事先放置滤纸并加入5m L无菌水。取在V8培养基上生长5 d的疫霉菌菌块置于子叶表面,未转化的黄瓜子叶放置疫霉菌菌块为对照,放置24 h后测量菌斑大小。通过抗体芯片分析疫霉菌侵染前后的黄瓜子叶总蛋白,筛选获得了60个具有显著丰度差异的响应蛋白,其中CsCAT1蛋白丰度在侵染前后表现出极显著差异。在pGWB5-CsCAT1瞬时转化的黄瓜子叶中CsCAT1表达量提高了约5倍,子叶受疫霉菌侵染后出现大面积菌斑,表现出敏感表型。pK7GWIW-CsCAT1瞬时转化的黄瓜子叶中Cs CAT1表达量降低约50%,表现出对疫霉菌的抗性表型。因此CsCAT1蛋白丰度与黄瓜疫霉菌抗性具有关联性,可能直接参与了疫病的抗性调控。