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肠道病毒71型(entero virus 71, EV71)是继脊髓灰质炎病毒后出现的又一具有神经嗜性的肠道病毒。EV71感染后临床症状表现多样,一般只引起典型的手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD),严重者可出现神经系统并发症,甚至死亡。EV71的基因组包括一个开放阅读框(open reading frame, ORF)及两边的5’非编码区(5’untranslated region,5’UT R)和3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)。目前,对于EV71的致病机制,特别是导致严重中枢神经系统(central nervous system, CNS)感染的机制尚未取得突破性进展。不同的EV71毒株引起不同的临床症状,除了个体易感因素外,病毒本身的复制能力在EV71的致病中发挥着重要作用。据此,本论文首先研究了分离自不同临床表现患儿中的EV71不同毒力表型株的复制情况,并进一步通过微复制子和反向遗传技术研究5’UTR区在病毒复制中的作用。目的：1.本研究首先对EV71不同毒力表型株做复制差异分析,以期发现EV71不同毒力表型株在RD细胞中的复制差异,并明确复制能力与EV71致病机制之间的关系。2.构建EV71的微复制子体系,研究EV71非编码区对病毒表达和复制的影响机制。3.构建EV71全长感染性克隆cDNA以及5’UTR置换的重组病毒,研究5’UTR区在病毒复制中的作用。方法：1.将EV71高毒力表型株(SDLY107和SDLY52)和低毒力表型株(SDLY11和SDLY1)感染RD细胞后,在不同的温度下(37℃ VS 39.5℃)进行培养,每12h取一次上清样。连续取4天。样本放于-80℃保存,样本取完后进行样本病毒RNA的提取,并进行逆转录反应。对逆转录的cDNA进行实时荧光定量PCR检测(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)。每12h作为一个病毒生长检测点检测病毒的复制曲线以期发现EV71不同毒力表型株在RD细胞中的复制差异。2.以SDLY107的基因组为模板,PCR扩增EV71的5’UTR与3’UTR,以EGFP基因替换EV71的ORF区,构建EV71的微复制子体系pMD-19T-5’UTR-EGFP-3’UTR。研究EV71非编码区对病毒表达和复制的影响机制。3.采用分段扩增的方法扩增SDLY107毒株的基因组,采用酶切连接的方法构建EV71的全长感染性克隆pCDNA3.1(+)-SDLY107.将pCDNA3.1(+)-SDLY107质粒线性化,并以其为模板进行体外转录,转录的RNA转染RD细胞并培养。细胞病变(cytopathic effect, CPE)产生后收获病毒并接种新的RD细胞,反复盲传直至CPE稳定后收获病毒即拯救病毒。4.以EV71低毒力表型株SDLY1的5’UTR置换EV71高毒力表型株SDLY107的5’UTR,构建重组质粒pCDNA3.1(+)-SDLY107-1。将拯救的野生型SDLY107和重组病毒SDLY107-1以不同感染剂量感染RD细胞,并在不同的温度下培养,以qRT-PCR检测病毒的复制曲线。结果：1.EV71高毒力表型株(SDLY107和SDLY52)和低毒力表型株(SDLY11和SDLY1)的生长曲线显示,在高温(39.5℃)下,高毒力表型株的复制能力显著高于低毒力表型株。而培养温度为37℃时,高毒力表型株和低毒力表型株的复制能力没有显著差异。此外,在高温下进行培养时,高毒力表型株和低毒力表型株的复制均受到抑制。说明EV71高毒力表型株是温度耐受型毒株,而EV71低毒力表型株是温度敏感性毒株。2.EV71的微复制子体系显示,在转染5’UTR-EGFP-3’UTR RNA的RD细胞中能观察到荧光,而转染EV71 UTR区缺失的EGFP RNA时并无荧光蛋白的表达,说明UTR区是EV71蛋白表达的调控区。然而,EV71的微复制子体系在RD细胞中没有出现RNA复制现象,说明只含有EV71的UTR区并不能独立完成RNA的复制,此外还需要ORF区中某些关键元件的参与。3.细胞培养和复制曲线检测结果发现EV71拯救病毒的致细胞病变和生长特性与野生型EV71基本一致。证实EV71拯救技术成功。4.在高温(39.5℃)培养条件下,我们发现对EV71的5’UTR进行交换后(高毒力表型株的5’UTR被低毒力表型株置换),EV71的复制能力明显受到影响,即置换低毒力表型株的5’UTR后,EV71高毒力表型株的复制能力下降。而在常规温度(37℃)下,重组病毒和母本病毒的复制能力没有显著区别,说明5’UTR与EV71不同毒力表型株复制差异有关,并且5’UTR区存在温度敏感位点。结论：1.EV71不同临床表型分离株在高温下复制能力不同,这可能是EV71不同毒力表型导致不同临床症状的致病机制之一。2.5’UTR替换之后,EV71强毒力表型株在高温下的复制能力明显减弱,说明5’UTR是EV71致病机制中重要的毒力决定位点区。