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第一部分SP-B中间产物特异性抗体的制备[目的]制备表面活性物质蛋白(surfactant protein, SP) B加工处理过程中部分中间产物的特异性抗体。[方法]利用Lasergene7.0和Macvector11.0.4软件进行抗原表位分析,确定作为抗原的3条多肽序列,将人工合成的多肽与钥孔戚血蓝(keyhole limpet hemocyanin, KLH)偶联,与弗氏佐剂乳化后以皮下多点注射的方式多次免疫兔,每条多肽免疫2只兔,制备兔抗血清,间接ELISA检测免疫前血清背景和免疫后血清效价,收集效价达到指标的血清后采用抗原亲和纯化方式纯化抗血清,SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度,间接ELISA法检测纯化后抗体效价。[结果]6只兔免疫前血清背景均低,适合用于制备抗血清,免疫后抗血清效价均达到要求,每条多肽选择一只兔抗血清进行抗原亲和纯化,所得抗体纯度高,效价达到要求。[结论]成功制备了3种SP-B中间产物特异性多克隆抗体。第二部分真核表达载体pIRES2-EGFP-SP-B-C/T1580的构建[目的]构建两种SP-B基因变异型的真核表达载体pIRES2-EGFP-SP-B-C/T1580。[方法]以pEE14-SP-B-C/T1580为模板,PCR扩增SP-B-C/T1580cDNA,采用双酶切PCR产物和pIRES2-EGFP空质粒,将目的基因与pIRES2-EGFP酶切产物连接,连接产物转化大肠杆菌,卡那霉素选择培养后提取质粒进行测序鉴定,得到pIRES2-EGFP-SP-B-C/T1580,采用脂质体法转染293T细胞系,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在293T细胞中的表达,逆转录-聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(reverse transcription-polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, RT-PCR-RFLP)检测SP-B-C/T1580mRNA的表达,Western blot检测SP-B蛋白的表达。[结果]两种SP-B基因变异型的真核表达载体pIRES2-EGFP-SP-B-C/T1580含有完整的SP-B cDNA,在1580位点碱基序列分别为C和T,转染293T细胞后有相应的mRNA及蛋白表达。[结论]成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-SP-B-C/T1580。第三部分SP-B-C/T1580A549单克隆细胞株的建立[目的]建立SP-B-C1580A549单克隆细胞株和SP-B-T1580A549单克隆细胞株。[方法]采用脂质体法将pIRES2-EGFP-SP-B-C/T1580转染A549细胞,转染24h后稀释传代,48h用含G418的细胞培养液进行筛选培养得到稳定转染pIRES2-EGFP-SP-B-C/T1580的A549细胞,采用有限稀释法和培养皿法挑选单细胞克隆,PCR-RFLP检测SP-B-C/T1580mRNA的表达,Western blot检测SP-B蛋白的表达。[结果]含400μg/ml G418的细胞培养液筛选培养12天可得到稳定转染pIRES2-EGFP-SP-B-C/T1580的A549细胞,挑选多株单细胞克隆进行鉴定,最终两种质粒转染的细胞各得到一株单细胞克隆,在SP-B1580位点碱基分别为C和T,有相应的SP-B蛋白表达。[结论]成功建立了可稳定表达相应SP-B蛋白的SP-B-C1580A549单克隆细胞株和SP-B-T1580A549单克隆细胞株。第四部分SP-B-C/T1580基因多态性与高氧致A549细胞损伤的关系[目的]观察SP-B-C/T1580A549细胞在高氧条件下生物学性状的变化,检测高氧和常氧条件下SP-B表达、加工,以及SP-A表达的变化,探讨SP-B-C/T1580基因多态性与A549细胞高氧损伤的关系及机制。[方法]将SP-B-C/T1580A549细胞置于高氧或常氧中培养,取培养24h、48h、72h、96h的细胞,MTT法检测细胞增值,台盼蓝染色法和LDH法检测细胞损伤和死亡,TBA法检测细胞脂质过氧化程度,流式细胞仪检测细胞凋亡,western blot检测SP-A蛋白表达,western blot与激光共聚焦显微镜联合检测SP-B蛋白表达及加工处理。[结果]高氧24h、48h对两种细胞的损伤及生长的抑制率无显著差异,高氧72h、96h引起SP-B-C1580A549细胞的损伤、生长的抑制,以及脂质过氧化程度显著强于SP-B-T1580A549细胞(P<0.05)；高氧72h两种细胞均可见少量死亡,高氧96h,两种细胞死亡增多,SP-B-C1580A549细胞死亡显著多于SP-B-T1580A549细胞(P<0.05)；流式细胞仪检测发现高氧72h以细胞死亡为主,96h以细胞凋亡为主,高氧72h和96h引起SP-B-C1580A549细胞死亡及凋亡均多于SP-B-T1580A549细胞(P<0.05)；高氧引起SP-B前体蛋白及中间产物表达增多,高氧24h、48h、72h、96h SP-B-T1580A549细胞内SP-B前体蛋白及25kDaSP-B中间产物的表达均显著多于SP-B-C1580A549细胞(p<0.05),高氧48h、72h、96hSP-B-T1580A549细胞内17kDaSP-B中间产物的表达显著多于SP-B-C1580A549细胞(p<0.05)；高氧可引起SP-A表达增多,高氧24h、48h、72h、96h SP-B-T1580A549细胞SP-A表达显著强于SP-B-C1580A549细胞(P<0.05)。【结论]SP-B1580位点T等位基因对A549细胞高氧损伤具有保护作用,其机制可能与促进了SP-B的表达及加工处理,SP-A的表达增多有关。