论文部分内容阅读
β-胡萝卜素是自然界中以全反式结构存在于胡萝卜、木瓜等诸多绿色蔬菜中的一种天然类胡萝卜素,因其含有11个共轭碳碳双键,而具有良好的抑制单线态氧、抗氧化、淬灭自由基等作用,并具有延缓衰老、防癌和抗癌等功能。解脂亚罗酵母作为一种产油微生物,遗传背景清晰,油脂含量高,胞内含有的β-胡萝卜素合成前体比较丰富,安全性也较高,在转基因方法生产β-胡萝卜素的领域中,得到越来越多的重视和应用。三孢布拉霉是一种以番茄红素作为其中间代谢产物,自身能合成天然β-胡萝卜素的微生物。本研究利用三孢布拉霉类胡萝卜素合成基因—八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶基因(carRA)、八氢番茄红素脱氢酶基因(carB)构建一株具有合成β-胡萝卜素能力的解脂亚罗酵母重组菌株。获得主要研究结果如下:(1)解脂亚罗酵母中β-胡萝卜素生物合成途径的构建。从供体菌三孢布拉霉菌中克隆色素合成基因carRA和carB,以及解脂亚罗酵母中GGS1基因,构建表达质粒 native pJN44-carRA/carB、native pJN44-carRA/carB/GGS1,在解脂亚罗酵母中表达。对外源的carRA和carB基因进行密码子优化后,与GGS1共同构建表达质粒 opt pJN44-carRA/carB、opt pJN44-carRA/carB/GGS1 在解脂亚罗酵母中表达。摇瓶发酵测定其生物量,提取并分析β-胡萝卜素含量。HPLC结果显示native AB、native ABG菌株中没有β-胡萝卜素,密码子优化后得到的opt AB菌株中β-胡萝卜素含量为0.0089 mg/g DCW,而opt ABG菌株中β-胡萝卜素含量为6.16 mg/g DCW。(2)opt carRA/carB及GGS1与MVA途径中关键基因tHMG共表达。利用ExPASy软件对HMGR和tHMG(HMGR催化域)进行生物信息学分析。分析结果表明HMGR全长3000 bp,前半部分跨膜区较多;HMGR蛋白和tHMG蛋白的二级结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主,说明这两种蛋白在二级结构上具有很高的相似性;三级结构表明这两种蛋白均以同源四聚体的状态存在,其催化域在第441～875位氨基酸处。引入标记分子GFP与tHMG基因融合表达,激光共聚焦结果显示,融合表达质粒pJN44-tHMG/GFP在488 nm处有绿色荧光,说明tHMG基因已经表达且具有功能。以表达质粒optpJN44-carRA/carB/GGS1为基础,构建含tHMG基因的表达质粒opt pJN44-carRA/carB/GGS1/tHMG,转化至解脂亚罗酵母,得到重组的解脂亚罗酵母菌株optABGtH。摇瓶实验测得optABGtH菌株中β-胡萝卜素含量可达26.03 mg/g DCW。(3)对最优菌株(opt ABGtH菌株)进行发酵罐培养并进行分离纯化和结构表征。全波长扫描结果显示,重结晶产物最大吸收峰在450 nm处,与β-胡萝卜素标准品一致;HPLC结果显示,重结晶产物保留时间(Rt = 20.307 min)与β-胡萝卜素标准品(Rt = 20.233 min)基本一致;红外光谱分析结果显示,重结晶产物特征峰位置(3408cm-1、622cm-1、1452 cm-1、962cm-1、611cm-1),进而确定发酵产物为β-胡萝卜素。本研究构建了三株具有β-胡萝卜素合成能力的解脂亚罗酵母重组菌株,为进一步研究提高β-胡萝卜素产量奠定了基础,同时也为解脂亚罗酵母体内合成其他类胡萝卜素提供了参考依据。