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抗菌肽系统是两栖类最重要的先天性免疫防御系统之一。基因复制后的正选择和平衡选择作用维持了两栖类抗菌肽极高的多样性,与病原微生物进行协同进化。基因复制后,若不同分子进化方向不同,那么一定存在另外一些分子承受了很强的负选择作用,为其他分子在适应性进化过程中提供种群基本生存保障。为了验证这一假设,我们采用东洋界和古北界的广布种黑斑侧褶蛙(Pelophylax nigromaculatus)为研究对象,选择了3种具有广谱抗菌能力的抗菌肽Temporin、Esculentin-1N和Esculentin-2Na,研究其基因拷贝数、等位基因数以及变异方式。黑龙江哈尔滨(HRB)、山东东营(DY)、湖北武汉(WH)和广东茂名(GD)4个地理种群的数据显示,一个体基因组中共有7个Esculentin-1N基因单倍型、8个Temporin基因单倍型,确定两基因中至少存在4个基因座位。Temporin基因的8个单倍型全部编码同一种抗菌肽,群体分析(n=20)表明,Temporin基因成熟肽编码区无任何变异,而内含子和3’UTR区域的遗传多样性显著高于外显子2和中性核基因FfBI7内含子,排除了近期的复制事件和选择清除作用,支持强烈负选择和基因转换作用保持了Temporin基因极低的遗传多样性。Esculentin-1N基因则编码了4种不同抗菌肽,共发现4个变异位点,其中3个非同义突变。中性检验法、非保守与保守氨基酸变化比值和最大似然法均检验到正选择作用于Esculentin-1N基因,但没有达到显著性水平。支持低等程度正选择作用维持了Esculentin-1N基因较高的多样性。Esculentin-2Na为单座位基因,6个地理种群(增加黑龙江抚远-FY和河北唐山-TS)127只个体的分析发现,成熟肽编码区11个突变位点,8个为同义突变;中性检验参数显著小于0(P<0.05);Jukes-Cantor修正的Nei-Gojobori法计算所得dN/dS显著小于1(P=0.0176)；最大似然法对每个氨基酸位点所受选择压力分析没有发现正选择位点的存在(P=1),且92%的氨基酸位点后验平均(o<0.2,后验概率支持均大于95%：单倍型网络呈星状分布并由短枝长相连接。支持Esculentin-2Na抗菌肽编码基因受到了强烈负选择压力的作用。上述结果表明,Temporin和Esculentin-2Na基因受到强烈的负选择作用,在黑斑侧褶蛙抗菌肽系统中承担了基础免疫防御功能,而Esculentin-1N基因受到了低程度正选择作用,代表了抗菌肽的适应性进化。为辅助对黑斑侧褶蛙抗菌肽基因进化模式的研究,我们基于线粒体控制区和中性核基因对6个地理种群黑斑侧褶蛙种群的遗传结构和遗传多样性进行了研究。结果再次验证了东北支系和大陆支系的存在,大陆支系又分支为支系A各支系B。大陆支系B仅存在TS和WH种群共享单倍型,大陆支系B共享单倍型则包括了TS、DY、WH、GD四个种群。支持支系B起源于西部高地,支系A起源于东南部沿海地区。