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金黄色葡萄球菌是引起化脓性感染和院内感染很常见的病原微生物,由于其耐药性变异以及持留菌的产生,给临床治疗带来了很大的困难,是引起反复感染和慢性感染的重要原因,急需寻找新的抗菌药物用于治疗。目前可选用治疗的药物少,尤其是缺乏针对持留菌治疗的药物。因此,积极寻找有效的抗金黄色葡萄球菌尤其是针对其持留菌的药物具有重要意义。小檗碱（Berberine）又名黄连素,是从中药黄连、黄柏等植物中提取的生物碱,具有广泛的抗菌等药理活性,但其抗菌机制尚未完全探明。本研究对小檗碱抗金黄色葡萄球菌及其持留菌的作用进行了研究,并对其作用机制进行了探讨。目的:1.探讨小檗碱抗金黄色葡萄球菌及其持留菌的效果及影响因素。2.研究小檗碱抗金黄色葡萄球菌及其持留菌的机制。方法:1.选用诺氟沙星（20μg/ml）、利福平（0.2μg/ml）、庆大霉素（40μg/ml）和万古霉素（40μg/ml）分别在胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptone Soy Broth,TSB）和营养肉汤（Nutrient Broth,NB）中对金黄色葡萄球菌进行暴露实验,测定不同生长期金黄色葡萄球菌持留菌的形成状况。2.采用微量肉汤稀释法测定NB中小檗碱抗金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration,MBC）;选用氨苄青霉素（10μg/ml）和小檗碱（250μg/ml）分别在TSB和NB中进行暴露实验,测定小檗碱抗金黄色葡萄球菌及其持留菌的效果。3.分别用金黄色葡萄球菌TSB培养滤液、生理盐水、NB培养滤液重悬生长于TSB或者NB中稳定期的细菌,选用氨苄青霉素（10μg/ml）和小檗碱（250μg/ml）开展暴露实验,测定培养基因素对小檗碱抗金黄色葡萄球菌持留菌的影响。4.用培养后的TSB和NB滤液原液以及调整了pH的滤液重悬已形成大量持留菌的金黄色葡萄球菌,选用氨苄青霉素（10μg/ml）和小檗碱（250μg/ml）开展暴露实验,测定培养基的pH对小檗碱抗金黄色葡萄球菌持留菌的影响。5.抽提培养24h和培养24h后用小檗碱（250μg/ml）处理3h的金黄色葡萄球菌总RNA,采用转录组测序测定小檗碱处理后金黄色葡萄球菌基因组转录的变化,选用RT-qPCR进行结果验证,生物信息学分析转录组测序的结果,探讨小檗碱抗金黄色葡萄球菌持留菌的机制。6.诱导获得耐高浓度小檗碱的金黄色葡萄球菌突变株;提取基因组DNA并重测序后,PCR验证重测序结果,采用生物信息学分析其突变位点和相关基因;探讨小檗碱抗金黄色葡萄球菌的机制。结果:1.在TSB和NB中,稳定期的金黄色葡萄球菌培养物对致死浓度的诺氟沙星、利福平、庆大霉素和万古霉素均可产生耐受,表现为药物作用7天后仍有大量的活菌存在,而对数期的细菌在作用2天后被全部杀死。庆大霉素对NB中培养至稳定期的金黄色葡萄球菌在作用3天后可以被全部杀死。2.小檗碱在NB中抗金黄色葡萄球菌的MIC和MBC范围分别为62.5μg/m L125μg/m L、125μg/mL250μg/m L;2倍MIC的小檗碱对NB中培养至稳定期的金黄色葡萄球菌作用24 h后即可杀死全部细菌,对TSB中同样条件培养的培养物没有产生显著的抗菌活性,药物作用7天时仍有大量活菌存在（8.19±0.13）。在TSB和NB中培养至稳定期的金黄色葡萄球菌对10倍MIC的氨苄青霉素均产生耐受,作用7天时仍有大量活菌存在,活菌对数值分别为3.82±0.24和7.12±0.16。3.用NB滤液重悬的TSB和NB稳定期培养物沉淀对小檗碱的敏感性高,药物作用24小时均被杀死。用TSB滤液重悬的上述培养物沉淀对氨苄青霉素和小檗碱均产生抗性,在药物作用7天时活菌数分别为9.06±0.18和8.98±0.03。用生理盐水和NB滤液重悬的上述培养物沉淀对氨苄青霉素的作用敏感性略有增高,但比小檗碱的作用效果差,作用7天时活菌数分别为6.69±0.13和6.39±0.40。生理盐水的重悬培养物对小檗碱的敏感性较TSB滤液的重悬物也增高,药物作用72小时均被杀死。4.在pH 6.50的情况下,小檗碱在TSB和NB中均显示出抗稳定期金黄色葡萄球菌的作用,作用24小时细菌全部被杀死。反之,在pH 4.65的条件下,小檗碱失去了抗稳定期金黄色葡萄球菌的作用。氨苄青霉素在pH 6.50时有一定的抗稳定期金黄色葡萄球菌作用,但效果显著低于小檗碱,在pH 4.65时则失去抗菌作用。5.转录组测序结果显示,与药物未处理组比较,小檗碱处理组金黄色葡萄球菌有25个基因表达显著上调（NWMNtRNA26、NWMN0907、NWMNtRNA41、NWMNtRNA32、NWMNtRNA31、NWMNtRNA53、NWMN1874、NWMNtRNA22、NWMNtRNA33、NWMN1861、NWMNtRNA28、NWMNtRNA29、araC、NWMNtRNA27、NWMNtRNA54、NWMNtRNA45、NWMN1068、NWMNtRNA55、NWMN1556、NWMNt RNA24、NWMN0869、NWMNtRNA23、NWMNtRNA18、NWMNtRNA16、NWMN0678）,有18个基因表达显著下调（hisG、NWMNrRNA13、NWMNtRNA49、NWMNrRNA01、NWMNrRNA16、NWMNrRNA05、NWMNrRNA10、NWMNrRNA15、NWMNrRNA12、NWMNrRNA02、NWMNrRNA06、NWMNrRNA09、hisZ、NWMNtRNA11、NWMNtRNA47、hisD、ilvB、NWMN0387）。针对其中9个基因进行RT-qPCR验证,转录组测序的结果完全正确。经过生物信息学的分析,差异表达基因主要集中在RNA的代谢和组氨酸的生物合成等信号通路和途径。6.经过药物诱导获得了耐5倍MIC小檗碱的金黄色葡萄球菌突变株。此突变株的基因组DNA重测序结果显示,有意义的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点为42个,有意义的小片段的插入和缺失序列（insertion and deletion,InDel）的位点11个。这些突变基因集中分布在膜蛋白、离子运输、药物外排泵、细胞分裂、DNA损伤修复、RNA代谢、脂质代谢、糖代谢、氨基酸代谢等多个方面。PCR扩增的片段的测序结果与突变株相关基因比对,结果显示基因组测序获得的突变位点信息准确。结论:金黄色葡萄球菌在培养至稳定期时可形成大量持留菌。小檗碱在中性pH范围内具有很强的抗金黄色葡萄球菌及其持留菌作用。作用机制可能包括:抑制组氨酸的生物合成、影响DNA损伤修复、抑制RNA的代谢;干扰细菌的代谢、物质转运和菌体分裂等。