豚鼠实验性近视眼视网膜色素上皮细胞HGF表达变化及钙离子的研究

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目的:建立豚鼠镜片诱导型近视眼模型(Lens induced myopia,LIM),观察豚鼠眼球前部及后极部视网膜色素上皮(RPE)细胞中肝细胞生长因子(HGF)的表达变化。研究HGF在近视中的作用,并采用激光扫描共聚焦显微镜(SLCM)对正常组和LIM组RPE细胞的钙离子进行测定,从离子水平进一步探讨近视的发病机理。方法:取2周龄豚鼠10只,随机选取一只眼为实验眼(LIM组)对侧眼为自身对照眼(Self-control,SC组)。实验眼是采用离焦点的方法用-10.00D[1]凹透镜诱导成近视眼模型,实验前后检测每组豚鼠双眼屈光状态,用A超测双眼眼轴长度。用细胞酶消化法原代培养豚鼠眼球前部及后极部RPE细胞,并传1代。用免疫细胞化学法对培养细胞进行鉴定,并对每组前部及后极部RPE细胞HGF的表达进行定性半定量分析,用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)法检测前部及后极部RPE细胞HGFmRNA的表达。对豚鼠RPE细胞进行Fluo-3/AM负载,利用激光扫描共聚焦显微镜测定LIM组及SC组RPE细胞钙离子的变化。其结果用SPSS12.0统计软件进行统计分析。结果:1豚鼠实验性近视的诱导结果:豚鼠经过45天的凹透镜诱导,实验组与自身对照组比较,诱导出-6.70±1.93D的相对近视,眼轴延长了1.53±0.31mm,前后变化差异有显著意义(p<0.05)。2细胞培养及鉴定结果:豚鼠RPE细胞培养后2-3天开始有细胞贴壁生长,1周左右汇合,免疫细胞化学鉴定为RPE细胞。3免疫细胞化学研究结果:HGF在RPE细胞中的表达定位于细胞浆,细胞核无着色。LIM组前部和后极部表达多呈棕黄色,为+++;SC组前部和后极部表达多浅黄色,为+;LIM组和SC组各组自身前部及后极部比较,无显著性差异(p>0.05);LIM组RPE细胞前部和后极部的HGF的阳性表达率都明显高于SC组的前部和后极部,且有显著性差异(p<0.05)。4逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)结果:LIM组与SC组RPE细胞HGFmRNA均有表达。LIM组与SC组各组自身前部及后极部HGFmRNA表达无显著性差异(p>0.05);LIM组前部和后极部HGFmRNA表达明显高于SC组,且有显著性差异(p<0.05)。5激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测结果: LIM组与SC组RPE细胞均有钙荧光。LIM组前部及后极部钙离子的浓度明显高于SC组,且有显著性差异(p<0.05),而LIM组和SC组前部钙离子的浓度与后极部比较,差异无显著意义(p>0.05)。结论:凹透镜诱导可以引起明显的轴性近视;体外培养的豚鼠RPE细胞稳定表达HGF。LIM组RPE细胞中前部和后极部HGF及HGFmRNA的表达均明显高于SC组。说明透镜诱导豚鼠实验性近视眼RPE细胞中HGF无论在转录水平还是在蛋白表达上都增高,HGF在实验性近视眼RPE细胞中的活性升高,HGF通过间接方式参与实验性近视眼的形成。LIM组与SC组RPE细胞均显示较强的Ca2+荧光;LIM组前部及后极部RPE细胞胞浆内Ca2+荧光强度明显高于SC组。LIM组与SC组各自前部及后极部Ca2+荧光强度差别不大。表明透镜诱导豚鼠实验性近视眼球前部和后极部的RPE细胞中Ca2+浓度增高。Ca2+参与了豚鼠实验性近视眼的形成。
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