论文部分内容阅读
背景 目前原位肝移植是治疗暴发性肝功能衰竭公认有效的方法，但严重供体短缺及费用昂贵等问题限制了其广泛应用，有些患者甚至在等待供体过程中死亡，因此迫切需要一种方法能够暂时替代补充衰竭肝脏的功能，使病人能“桥接”肝移植或自行再生恢复，肝细胞移植作为治疗暴发性肝功能衰竭的一种选择在各种动物模型及临床应用中得到广泛证实，与原位肝移植比较具有创伤小、安全简单、一肝多用、抗原性低等优点，但移植的肝细胞增殖困难及供体缺乏等问题严重困扰着肝细胞移植的发展；肝干细胞即目前所谓的肝卵圆细胞，因其强大的增殖能力及向肝细胞和胆管上皮细胞等多种组织分化潜能，作为肝细胞移植理想的细胞来源已成为研究热点，但利用肝脏来源的肝干细胞移植治疗暴发性肝功能衰竭目前尚未见报道。中医中药在肝病治疗过程中积累了丰富的经验，近年来许多学者从天然中药中发现多种方剂和中药科属对肝损伤有很好的保护作用，茵陈汤具有利胆、保肝褪黄、抗炎抗菌等作用，已广泛应用于临床治疗各种肝炎。本课题分为三部分：第一部分在建立大鼠肝干细胞增殖模型的基础上分离、纯化大鼠肝干细胞，并移植治疗暴发性肝功能衰竭大鼠模型；第二部分将分离、纯化的人胎儿肝干细胞异种移植治疗SCID小鼠暴发性肝功能衰竭模型；目的是探索肝细胞移植治疗暴发性肝功能衰竭的可行性、有效性及可能的作用机理，为肝干细胞移植应用于临床治疗各种终末期肝病打下坚实基础。第三部分利用加味茵陈汤治疗暴发性肝功能衰竭大鼠模型，并以含中药血清作用于肝细胞体外损伤模型，从不同水平探索本组方的保肝、降酶及促进肝细胞再生作用，以更好的应用于临床，而且为进一步研究中药对肝干细胞的影响奠定基础。天津医科大学博士学位论文产r户r，与口I、弟一首1、力、肝干细胞移植治疗暴发性肝功能衰竭大鼠的实验研究 目的建立成年大鼠肝千细胞增殖模型，进一步进行肝干细胞的分离、纯化和鉴定，并移植治疗大鼠暴发性肝功能衰竭模型，以探索肝干细胞移植治疗一暴发性肝功能衰竭的可行性及有效性。方法为确定建立大鼠肝+细胞增殖模型的最佳给药剂量和时间雄性，将健康成年Wista:大鼠按二乙酞氨基荀给予剂量不同随机分为5组(5、10、15、20、25mg/kg B.W.)，按各自剂量每天一次连续灌胃处理给予二乙酞氨基菊，第5天行标准的2/3肝切除术 (手术当天不给予)，术后按术前各自剂量继续给予一乙酞氨基菊，观察动物耐受性，并于术后3、7、11、14天取病理标本，光镜及电镜下观察肝干细胞增殖情况，并进行SABC免疫组织化学染色以进一步鉴定是否符合肝厂「细胞的表型特点，并与单纯给予二乙酞氨基菊组及单纯肝切除手术组进行对照:选择15mg爪9 B.W.剂量每天一次连续灌胃处理给予二乙酞氨基菊，第5天行2/3月十切除术，术后按相同剂量继续给予11天，建立雄性大鼠肝干细胞增殖模型，以此模型为供体，利用改进的Seg】en胶原酶原位灌注及Percoll密度梯度离心分离、纯化大鼠肝干细胞，在倒置显微镜、电镜下观察细胞特点，免疫组织化学染色鉴定肝干细胞细胞标志，如甲胎蛋白、细胞角蛋白18和19、白蛋白及白细胞共同抗原，纯化的肝干细胞以DMEM培养液调整浓度lx一0621刀一于CO:培养箱培养(37OC，5%COZ)培养;雌性wista:大鼠随机分为治疗组(A组)和对照组(B组)，10%D一氨基半乳糖(1200mg/kgB.w.)腹腔一次注射诱导暴发性肝功能衰竭大鼠模型，给药24h后取培养24}:细胞悬液0.4 ml(l护细胞/ml)于肝脏中叶注射移植，对照组注射相同体积培养液，于移植前及移植后24、48、72h及lw取血测定肝功能指标如血氨、天津医科大学博士学位论文ALT、AST、TBIL，并采取肝脏标本进行病理检查，于移植后lw、Zw及4w取雌性受体原位(注射部位)、邻位(距注射部位!.SCm)川一脏组织应用PCR方法进行性别决定因子(sry)基因分析，以鉴定移植后雌性受体开卜朋一组织足否存在雄性供体肝干细胞。结果二乙酞氨基荀剂量巧mg/kgB.w.连续灌胃4天，第5天行2/3肝部分切除，后继续给予相同剂量]l天能建立较理想的仕卜「细胞增殖模型，病理切片HE染色可见汇管区及中央静脉周围大量增菊的嗜碱性小细胞，电镜下观察此种细胞具有卵圆形细胞核、细胞质少而淡、核/浆比例较大等特点，免疫组化染色证实甲胎蛋白、细胞角蛋白18和一l]9染色阳性，白蛋白及白细胞共同抗原染色阴性;以此模型为供体进行丹卜干细胞分离，所得细胞悬液经Perco”梯度离心后分为3层，在倒置显微镜下观察不同层面细胞特点，选择最底层(l .0709/m卜1 .1 10 g/]nl)细胞，特点为细胞体积较小，约为正常肝细胞1/2一1/5大小，大小不等，电镜下观察细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起，特点同肝干细胞模型片卜组织内增殖细胞，表现为原始幼稚未分化细胞的特点，免疫组化表明新分离的细胞与肝干细胞增殖模型内增殖细胞表现相同的细胞表型特点，培养2一3w内可见克隆样增殖结构形成，且细胞表面标志免疫组化染色特征无改变:平均细胞产量:(5.10士0.40)xlo6，Trypanblue拒染实验细胞活性率94.300，0土一590;0。)]{二厂细胞移植后A组(肝干细胞移植组