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为了提高嗜热芽孢杆菌CHB1产CGTase的工业化潜力,本论文对嗜热芽孢杆菌CHB1来源的CGTase基因进行克隆表达,研究其酶学特性,并从信号肽筛选、发酵条件优化和添加化学通透剂等方面探讨重组CGTase胞外分泌。论文主要研究内容与结果如下:1.将来源于嗜热芽孢杆菌CHB1的CGTase基因插入到分泌型原核表达质粒pET22b（+）的PelB信号肽序列下游,构建重组表达质粒pET22b（+）-cgt,并将其导入E.coli BL21中诱导表达,实现了重组CGTase的胞外分泌。2.采用镍柱进行一步亲合层析,获得电泳纯的重组CGTase。以α-环化活性为指标,重组CGTase的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0;该酶在40℃保温1h,酶活稳定,在50℃～80℃条件下,半衰期为35min～15min;Ca2+、Mg2+、Li+、Ni+对酶活具有促进作用,Na+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等金属离子对酶活产生抑制;该酶以可溶性淀粉为底物时的米氏常数Km为3.73 mg/mL,最大反应速度 Vmax=0.0202 mmol/L·min。3.为了比较不同信号肽对胞外分泌的影响,构建带有PelB信号肽和CHB1菌株自身信号肽的重组表达质粒pEASY-E2-PelB-cgt与pEASY-E2-CHBl-cgt,以及不带信号肽的pEASY-E2-cgt,同时以本实验室前期构建的带有OmpA信号肽的重组表达质粒pEASY-E2-OmpA-cgt作为对照;在相同的发酵条件下,OmpA信号肽介导重组CGTase表达效果最好,胞外酶活达到7.44U/mL,分别是PelB信号肽和CHB1自身信号肽的2.04倍和11.27倍。4.以重组质粒pEASY-E2-OmpA-cgt为研究对象,发现乳糖与IPTG均能诱导CGTase;IPTG抑制菌体生长,乳糖作为碳源促进菌体生长;乳糖诱导胞外酶活达到8.05 U/mL,而IPTG诱导胞外酶活仅为4.55 U/mL。以乳糖代替IPTG,初步优化的最佳胞外表达条件为诱导温度25 ℃、乳糖浓度0.5%、诱导起始菌浓度OD600=1.4,分批流加乳糖5次和一次性添加乳糖诱导无明显差异;培养条件为装液量50ml、接种量5%、初始pH 7.0;采用两阶段温度诱导效果更佳,在25 ℃诱导24h后升温至30 ℃,可有效促进胞外分泌;经上述优化,乳糖诱导重组CGTase的胞外酶活最高达到19.87 U/mL。5.SDS、Tween 80能抑制重组CGTase的胞外分泌;当在培养基中同时添加终浓度为0.6%甘氨酸和0.3%Triton X-100时,胞外酶活为14.27U/mL,是不加任何化学通透剂对照组的2倍左右。