本论文分为两部分，第一部分为纳豆激酶液体发酵过程的优化，第二部分为层析法分离纯化P450_BM-3。 纳豆激酶（Nattokinase，NK）是从日本传统食品纳豆发现的一种具有纤溶活性的酶。本论文考察了在种子瓶加入木糖对发酵过程的影响，1g·L^-1的木糖能缩短产纳豆激酶（NK）菌株（Bacillus subtilis HL-1）的延滞期，使纳豆激酶的酶活从1314IU·mL^-1提高到1698IU·mL^-1，接着在3.7升Bioengineering KLF2000型发酵罐进行培养，研究发现菌浓和溶氧是影响菌体产酶的重要因素，利用在稳定期维持溶氧在30％～40％之间，在菌浓下降时进行分批补料，最终发酵液中纳豆激酶的酶活由摇瓶时的1314IU·mL^-1提高到在3.7升发酵罐中的2348IU·mL^-1。 细胞色素P450_BM-3是从Bacillus megaterium中分离出来的一种单加氧酶，它能催化长链脂肪酸(C₁₂-C₂₀)ω-羟化以及非饱和长链脂肪酸的羟化或环氧化，其基因已经被克隆并在大肠杆菌中有效表达。本论文主要工作是将已构建好的表达P450_BM-3的质粒转入大肠杆菌DH5α中，对其发酵条件进行了优化，并通过层析方法有效地分离提纯P450_BM-3酶。 已构建好的表达P450_BM-3的质粒先转入大肠杆菌DH5α中，然后考察了氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）的浓度以及接种量对菌体生长的影响，结果表明Amp浓度的增加对菌体的生长有一定的抑制作用并且接种量的减少导致延滞期增长。P450_BM-3的培养条件被优化，结果表明接种量1％，发酵培养基装液量为100mL／500mL，FeCl₃的添加量为0.1mg／L，在OD₅₇₈（菌浓）达到0.5～1.3之间升温至42℃，诱导时间为5小时，能提高目标蛋白的表达量，为下游纯化提供较佳的原料。 对硫酸铵分级沉淀以及凝胶过滤分离P450_BM-3的条件进行了优化，结果表明35％～70％的饱和硫酸铵浓度适合P450_BM-3初分离，Sephacryl S-200凝胶过滤的流速为0.5mL／min，确定了以下分离纯化路径：发酵液离心收集菌体→细胞破碎离心收集上清液→35％～70％饱和硫酸铵分级沉淀→缓冲液溶解沉淀→Sephacryl S-200凝胶层析，纯化倍数2.316，酶活收率49.8％Abstraet nEAE一sepharose FF、ResoureeQ以及ANX三种介质分离纯化p45o^的结果表明，目标蛋白均能交换到三种介质上去，不同的是对P450BM-:特异性吸附不同，经sDs一PAGE电泳表明DEAE一sePharose FF纯化效果最差，不适合分离P450BM-，。确定了以下分离纯化路径:发酵液离心收集菌体一细胞破碎离心收集上清液一ResourceQ阴离子交换层析一SePhacry1S一200凝胶层析，纯化倍数3.4，酶活收率达18%。 通过对本实验室己经存在疏水介质的筛选表明，source 1 5150与Phenylsepharose枷High Perrormanee能较好地吸附目标蛋白P45o、了，对souree 1 5150吸附目标蛋白p45o、，的条件进行了一些优化，确定1 .oM（N H4）2504，pH7一8的缓冲液作为上样缓冲液，洗脱时梯度长度为4一SCV，流速为lmL/min的条件，可以较好地分离目标蛋白p45o、，。Phenyl sepharoseTM High Per伪rmanee当全部用10mM PBS洗脱缓冲液洗脱时，目标蛋白才能被洗下来。确定了以下分离纯化路径:发酵液离心收集菌体一细胞破碎离心收集上清液一35%一70%饱和硫酸按分级沉淀一上样缓冲液溶解沉淀一source 1 5150疏水层析^SephacrylS一200凝胶层析，纯化倍数13.5，酶活收率13.7%。