脓毒症指由感染引起的全身炎症反应综合征，其发生率以每年1.5％-8％递增，病死率却无明显的改善。高迁移率蛋1(HMGB1)是高迁移率族蛋白超家族成员之一，广泛存在于真核细胞核中最重要的非组蛋白，分子质量小，含量丰富，序列高度保守。1999年HMGB1首次报道作为新的潜在的晚期炎症介质参与了脓毒症的发病过程，是脓毒血症晚期的重要炎症介质。血管内皮细胞在脓毒症的发生发展中具有重要的作用。它不仅是脓毒症时受损的靶细胞，同时还通过其广泛的生物学功能主动地参与了器官功能的损伤。血管内皮细胞受到炎症刺激时可以释放HMGB1，促进细胞因子和E--选择素黏附分子的表达。　　 E-选择蛋白(E-selectin)，又称内皮细胞-白细胞粘附分子-1(endothelial-leukocyte adhesion molecule-1，ELAM1)，是一种重要的粘附分子，属选择蛋白家族。其表达具有严格的细胞特异性，仅发现其表达于血管内皮细胞及经特殊处理的血管平滑肌细胞。内皮细胞激活时内皮细胞表面或血浆中粘附分子表达的增加是各种类型的脓毒症的典型表现。血浆E-选择素的水平和脓毒症患者的SAPSII和MOF评分呈正相关。血浆E-选择素的增加反应了内皮细胞膜表达蛋白的增加，能直接反映内皮的激活或功能障碍。胞外HMGB1为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子，是启动和维持炎症瀑式反应的中心分子，与脓毒症等的发病机理关系密切。HMGB1在细胞核内的与DNA广泛的、非特异的结合，可与一些转录因子相互作用参与DNA复制、细胞增殖分化、基因转录等生命活动。Hox基因属于同源盒基因(Homeobox gene)，是与生物体发育密切相关的重要基因调控家族。核内的HMGB1可以与HOX转录因子相互作用增强了DNA的结合能力和转录活性。有研究发现，HOXA9参与了内皮细胞的E-选择素转录调节且HOXA9下调是内皮细胞激活的必要条件。因此，我们推测核内HMGB1可能通过HOXA9激活内皮细胞的作用进而调节E-选择素的表达。　　 本实验中，我们旨在构建短发夹的HMGB1基因的真核细胞表达载体，并将重组质粒转染到内皮细胞中，观察其对HOXA9基因和E--选择素的表达影响，探讨HMGB1基因表达对内皮细胞激活表达E--选择素转录调控可能的机制。　　 材料与方法：　　 一、构建短发夹的HMGB1基因的真核细胞表达载体　　 根据人的HMGB1基因的编码序列，设计3条干扰靶系列和1条对照序列，并在两端加入酶切位点，将合成的正反向寡核苷酸链退火形成双链DNA，并连接到酶切后的pRNA-u6.1/Neo载体上，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态菌，氨苄青霉素抗性筛选，挑去阳性克隆，采用DNA序列分析进行鉴定，构建的质粒分别命名为pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-1,pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-2,pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-3, pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-NC。　　 二、Realtime—PCR和Western blot检测重组质粒在人的脐静脉血管内皮细胞中干扰HMGB1表达的作用　　 脂质体介导法将pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3、NC)分别转染人的脐静脉血管内皮细胞中，转染48小时后收集各组细胞。提取蛋白质和RNA，进行western blot和reatime-PCR检测，筛选重组质粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3、NC)有效干扰HMGB1表达的的靶序列。　　 三、Realtime—PCR检测重组质粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1在人的脐静脉血管内皮细胞中对HOXA9表达的影响　　 脂质体介导法将pRNA-u6.1/Neo-HMGB1转染人的脐静脉血管内皮细胞中，转染48小时后收集各组细胞。提取RNA，进行Reatime-PCR检测HOXA9的mRNA的表达。　　 四、Realtime—PCR检测重组质粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1在人的脐静脉血管内皮细胞中对E-选择素表达的影响　　 脂质体介导法将pRNA-u6.1/Neo-HMGB1转染人的脐静脉血管内皮细胞中，转染48小时后收集各组细胞。提取RNA，进行Reatime-PCR检测E-选择素的mRNA的表达　　 五、Realtime— PCR和Western blot检测人工合成的干扰质粒SiRNAHOXA9在人的脐静脉血管内皮细胞中干扰HOXA9表达的作用　　 脂质体介导法将SiRNAHOXA9和对照质粒分别转染人的脐静脉血管内皮细胞中，转染48小时后收集各组细胞。提取蛋白质和RNA，进行western blot和reatime-PCR检测，验证SiRNAHOXA9干扰HOXA9表达的效应。　　 六、Realtime-PCR检测pRNA-u6.1/Neo-HMGB1和SiRNAHOXA9共同在人的脐静脉血管内皮细胞中对E-选择素表达的影响　　 脂质体介导法将pRNA-u6.1/Neo-HMGB1和SiRNAHOXA9共同转染人的脐静脉血管内皮细胞中，转染48小时后收集各组细胞。提取RNA，进行Reatime-PCR检测的E-选择素mRNA的表达。　　 七、统计学分析　　 SPSS17.0统计软件进行数据分析，所有结果均用x±s表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVO)方法和t检验比较各组间的统计学差异，P＜0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、成功构建短发夹的HMGB1基因的真核细胞表达载体　　 构建的质粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3、NC)经DNA测序鉴定证实HMGB1的shRNA表达载体构建成功。　　 二、在人的脐静脉血管内皮细胞中重组质粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1有效的干扰HMGB1表达　　 Western blot和Realtime-PCR结果显示pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3)均显著干扰了HMGB1在人脐静脉血管内皮细胞中的表达，pRNA-u6.1/ Neo-HMGB1-NC不具有干扰作用(P＜0.05)。　　 三、在人的脐静脉血管内皮细胞中重组质粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1增加了HOXA9的表达　　 Realtime-PCR结果显示在人的脐静脉血管内皮细胞中抑制HMGB1的表达可以促进HOXA9的高表达(P＜0.05)。　　 四、在人的脐静脉血管内皮细胞中重组质粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1降低了E-选择素的表达　　 Realtime-PCR结果显示在人的脐静脉血管内皮细胞中抑制HMGB1的表达可以降低E-选择素的表达(P＜0.05)。　　 五、人工合成的干扰质粒SiRNAHOXA9在人的脐静脉血管内皮细胞中有效的干扰的HOXA9的表达　　 Western blot和Realtime-PCR结果显示干扰质粒SiRNAHOXA9显著干扰了HOXA9在人脐静脉血管内皮细胞中的表达，对照的SiRNAHOXA9不具有干扰作用(P＜0.05)。　　 六、pRNA-u6.1/Neo-HMGB1和SiRNAHOXA9共同在人的脐静脉血管内皮细胞中增加了E-选择素的表达　　 Realtime-PCR结果显示，在人的脐静脉血管内皮细胞中抑制HMGB1的表达同时抑制HOXA9的表达可以增加E-选择素的表达(P＜0.05)。　　 结论：　　 1、成功构建了人的HMGB1基因的短发夹的真核细胞表达载体并且在人的脐静脉血管内皮细胞中有效的干扰了HMGB1的表达。　　 2、短发夹的HMGB1基因真核细胞表达载体在人的脐静脉血管内皮细胞中促进了HOXA9的高表达和E-选择素的低表达。　　 3、在人的脐静脉血管内皮细胞中核内的HMGB1通过HOXA9调节E-选择素的表达